第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的

摘要:腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。目前大多数生成rAAV的实验方案需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒(Ad)感染的培养细胞中。此方法的局限性包括(1) Ad辅助病毒污染rAAV，(2)rAAV的低产出，(3)生成有复制能力的AAV。在此报道中我们描述了新的辅助质粒(pH3和pH5)，排除了Ad共转染的需求。辅助质粒表达AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。当辅助质粒在没有Ad感染的情况下共转染到人293细胞中，rAAV载体产量超过了pAAV/Ad包装质粒的80倍。另外，有复制能力的AAV在rAAV制备过程中少于0.00125%。此系统的主要优点是(1)无需感染性的腺病毒(2)只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。我们相信该双质粒转染系统因其简便性和高产出而使AAV载体系统能被更广泛地使用。该系统尤其将对多rAAV载体的临床前分析有用 1．简介 腺相关

玛丽和乔是一对孪生子，她们拥有相同的遗传学特征而且共同生活在一个幸福的家庭里。随着他们的不断成长，两个人都非常喜爱体育和艺术，同样学习成绩优良而且几乎在每一个方面哪怕是细节方面都显示出了惊人的相似。然而等到成年以后，她们的生活和个性却产生了明显的差异：在玛丽二十岁出头的时候，一件恶梦般的事情发生了，她被诊断患有精神分裂症。 类似这样的例子长期以来一直使遗传学家们感到困惑：尽管拥有相同的DNA甚至常常是同样的成长环境，但“完全相同的”同卵双生子们有时却显示出了巨大的差别。 目前，研究者认为一些不改变DNA序列，被称为基因外遗传学改变的某些基因组的细微修饰可能与此有关，他们认为这样可以解释遗传学上完全相同的孪生子之间存在的差异。但绝大多数的遗传学家对基因外遗传学的接受也仅此而已，仍囿于“所有人类疾病的起因均与DNA序列的变异有关”。对于“基因外遗传学可能是世界上的数种病的发病根源的猜想不屑一顾，然而基因学上的突破并未能对其传统观点作出有力的支持。或许，现在是转换思路，重新考虑基因外遗传学与疾病关系的时候了。” 基因外遗传 人体内的每一个细胞均携带有构成人身体所需的全部成分的编码基因，

1. 什么是Reads? 高通量测序平台产生的序列就称为reads。 2. 什么是Contig？ 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。 3. 什么是Scaffold？ 基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。 4. 什么是Contig N50？ Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序，如获得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。举例：Con

15天构建三个重组质粒经验－－态度决定成败－－献给刚刚进入实验室的新战友 前言： 我自己的课题是单克隆抗体的制备及其初步应用，总共花了六个月的时间基本做完。做完了之后我想现在单抗的文章不可能发到比较好的杂志，就想能不能利用剩下的将近一年的时间来再做一个比较好的课题。 下面是从我的试验记录上面摘抄的一部分，也就是构建载体的这一段时间所记录的东西。 第一天： 同实验室的一位同学是做某蛋白上面的一段的免疫活性的研究，我就像我能不能将此蛋白剩下的几段也做出来，然后共同进行免疫活性的研究，这样的文章总要比单抗的文章有档次一些。产生了这个想法之后当天晚上查找此蛋白的全基因序列，然后利用生物信息学软件分析之后初步确定了如何将此蛋白进行分割表达。 第二天： 引物设计（primer5.0），花了一上午的时间，三个引物的评分分别是56、58、62。评分都不太高，但是有那位同学的质粒做模板，做PCR应该不成问题。中午给上海生工发出E-MAIL，合成引物。 第三天： 手工提取质粒，准备PCR之用。提取结束已经接近中午，然后室温放置EP管挥发酒精知道晚上10点左右，跑胶。看到很亮的两条带，由此

超声换能器的判断有一下的方法： 1、超声的换能器正常工作电阻约为：大于等于 20M 欧姆，兆欧表测试。 2、测量如果开路的视为存在问题。 3、观察换能器是否有打火拉弧烧黑现象。 超声波振动子作为超声波设备最最主要的配件之一，超声波能量的发出就是超声波振动子，振动子可以决定整台机的稳定性，一个好的超声波振动子起到非常大的作用,所以在平时的保养和维护工作也很重要,接下来给大家讲讲超声波振动子故障原因及解决方法： 1、超声波设备一定要放在干燥的地方,以免超声波振动动子受潮,就会影响正常的工作,超声波振动子受潮的话可以放进烘箱设定 100℃ 左右烘干 2 小时或者使用电吹风去潮至阻值正常为止。 2、在日常超声作来中一定要注意不能经常负荷的生产，同时很多超声波机台的发兰盘是正反 180 度旋转，不能 360 度旋转这样很容易把振动子线绕到一块。 3、超声波振动子脱胶,超声波振动子脱胶以后超声波电源输出的功率正常,但是由于振子与振动面连接不好,长时间工作的话会烧坏振子，超声波振动子脱胶一般要请专业超声波厂家进行维修或更换。

第一章　质粒DNA的碱裂解法提取与纯化——【核酸基因技术版】 已有zein 和newdragon 编写初稿，请两位战友商量并及时更新，采用一个版本！ 第二章　基因组DNA的碱裂解法提取与纯化——【核酸基因技术版】 已有zein 编写初稿，请及时更新！ 第三章　真核细胞DNA的制备与定量——【核酸基因技术版】 已有yujz149 编写初稿，请及时更新！ 第四章 噬菌体DNA提取——【核酸基因技术版】 第五章　核酸电泳——【核酸基因技术版】 已有wangjun报名 编写初稿！ 第六章　感受态细胞的制备——【核酸基因技术版】 已有zein 编写初稿，请及时更新！qqyxf报名编写初稿，请及时奉上！ 第七章　质粒转化与转染——【核酸基因技术版】 已有qqyxf 、polarfox 报名 编写初稿，请及时奉上！ 第八章　DNA分子的限制性内切酶消化——【核酸基因技术版】 已有三七花、wangjun 报名 编写初稿，请及时奉上！ 第九章　DNA片段回收与纯化——【核酸基因技术版】 已有wangjun报名 编写初稿！ 第十章　目的基因的亚克隆——【核酸基因技术版】 已有wangju

本人倾情上传本校基因工程专业的试题及答案。作为送给核酸技术讨论版的礼物。希望版主加分。 基因工程与基因体外表达练习题及其答案 一、填空题 1． 基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2． 基因工程的两个基本特点是： (1)____________，(2)___________。 3． 基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4． 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小 的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5． 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。 8

精华 【连接转化讨论专栏】 [精华] 连接反应大全 【鸡毛蒜皮】之5－连接反应中巧用内切酶 连接技术讨论区 PCR与连接 PCR连接 关于PCR产物及酶切产物与载体的连接 PCR产物与表达载体连接的问题 PCR产物能够直接用做T-载体的连接吗 平端连接 平端连接高手（讨论专贴） 平端连接 平端连接的怪现象? 平端连接的怪现象(2) 平末端连接的条件？ 平末端连接构建载体的一些个人经验 连接问题集 连接的问题 关于连接 [求助]偶的连接问题！ 还是连接问题 求助：DNA连接问题 关于连接的问题 紧急求教：关于连接的问题 请教一个关于连接的问题 关于连接问题（新手请教） 连接又失败了，急 你喜欢新的连接方法吗？效果！！！ 连接为什么连不好啊 连接反应 一个2.2+4.3kb的连接竟然连不上，很恼火！ 请教加接头法连接的问题？ 为何连接如此的困难？ 连接 ----我进入了一个怪圈 介绍一种不需胶回收就可直接连接的方法 一个关于载体去磷酸化和连接的方案 连接心得体会 关于连接反应的心得 三个片断连接的心得 我的一点试验总结（续）：线性载体与插入片段连

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:设计，实验和分析siRNA效应 转录后基因沉默，也称为RNA干扰，是指双链RNA分子阻断或者降低同源基因的表达的现象。这种现象可能是作为一种抑制病毒感染和转座子跳跃的细胞防御机制(Ketting et. al., 1999; Tabara et. al., 1999; Jensenet. al., 1999; Ratcliff et. al., 1999)。在体内，双链RNA被内源的核糖核酸酶降解为21-23个碱基大小的小分子干扰RNA（small interfering RNAs ，siRNAs)。这种21—23碱基大小的双链RNA被认为是在哺乳动物细胞中介导RNAi反应的效应物。 RNAi技术已经被广泛应用于线虫和果蝇中基因功能的鉴定。通常将体外转录得到的长双链RNA引入这类生物中来诱导RNAi，但是这种方法在哺乳动物细胞中行不通，因为长片断的双链RNA在哺乳动物细胞中诱发强烈的抗病毒反应，导致整体基因表达模式的改变，而非特异的基因沉默反应。最新的实验表明哺乳动物细胞中导入小分子双链RNA则不会引发类似的抗病毒反应，而能够有效的找到特异的目标靶RN

核酸、核苷酸的基本换算DNA电泳基本参数Pfu DNA聚合酶BCIP/NBT & BCIP/INTHistoChoice MBHistoChoice Clearing Agent核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol1 μg M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol1 μg l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol 1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 μg1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 μg1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg1 pmol SV40 DNA (5

我用附件传不上来，只能用这种笨法了，希望大家用的上 　　近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 　　一、RNAi的分子机制　　通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。　　在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA

最近，摸索了一下 PEG 沉淀 PCR 产物的方法，贴出来，与大家共享。摸索这个方法的目的主要是，探索一种方法，能将 PCR 产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉 200bp 以下的小片段 DNA，用于 DNA 测序。有文献和方法说，不同浓度的 PEG 能沉淀不同长度的 DNA，所以，先做了一下不同 PEG 浓度对 DNA 沉淀的作用，见下图，标本是用的 50bp DNA Marker，上一行 Marker 溶解在纯水里面的，下一行 Marker 溶解在模拟的 PCR 反应体系里面的（除了没加 Taq，其他与常规 PCR 一致），此目的是验证一下 PCR 体系里面的盐离子对 PEG 沉淀是否有影响。总起来，结果还比较满意，可以看到，PEG 浓度越高，能沉淀出来的 DNA 片段越小，并且，PCR 反应体系里面的盐离子对 PEG 沉淀影响似乎不大，我测序的标本都在 300bp 以上，所以，最终选择的 PEG 浓度为12％。方法：96 孔 PCR 板操作1、20μLPCR 产物加入 5μL 5M 的 NaCl（终浓度 0.5M）；2、加入 25μL 24％ 的 PEG8

第一节 基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列． 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和， 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-Value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP） 基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。 蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics） 第二节 真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点： ， ①真核

半个月前我正式进入实验室学习，老实说，这半个月是痛苦的，也让我感受颇多，这里我愿意把自己的心得和大家分享，尤其希望对那些和我一样刚进实验室或将要进的园友有点帮助。 今年是我研究生的第二年，第一年是理论学习，没有进实验室，我老板是领导，脱离科研好多年了，对我们的学习几乎没什么指导，对这一阶段，我的惨痛教训如下： ⒈学习，学习，努力学习，千万别逃课，崩管老师好不好，听听总好，说不定什么时候就有启发，千千万万是那门分子生物学及技术，一定要竖着耳朵听，我现在后悔呀，为什么嫌老师普通话说的不好，逃了那么多课，要用的时候一点记忆也没有，只有翻书从头找 ⒉如果你有条件，尽早去实验室帮帮忙，哪怕就是帮师兄师姐刷刷瓶子，配配试剂也好，我的体会是分子生物学实验室的工作贵在细，器皿的不同洗刷方法，试剂的配制和保存中的学问就很多，要由小及大，注意细节，不要好高骛远 ⒊如果这时你的课题已基本可以确定一个大方向了，建议你看一些综述，对你将来的实验大有帮助呀 ⒋好好听文献检索课，有空来丁香园，就在文献检索区待，要在你开始设计实验路线开始查文献前入门呀，我就是开始太晚，现在是边查边学，滋味不好受呀 现在说说进入实验室

Blast指南 http://www.dxy.cn/bbs/user/download/385095/BLAST%20tutorial%20%28part%201%29.htm 如何进行BLAST,如何分析BLAST后的结果,请访问 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/tut1.html blast 讲座幻灯片 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=461837&sty=3&keywords=blast 所谓的BLAST是为了协助 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=664643 blast结果分析求助 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1640205 请教blast的一个问题 http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/326516_0.html 转载-网页方式下利用BLAST 程序进行基因／蛋白质序列

一．实验材料及其仪器 1．实验仪器 iQ5 Real Time PCR Detection System： Bio-Rad 2．实验材料及试剂 All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit： GeneCopoeia (Cat. No. R0101S ) 验证模板：人源十个不同的组织所制备的cDNA 测试引物：共5 对（具体引物序列等详细信息附在产品说明书处，此处略） Catalog# Primer ID Mature_Acc Mature_ID PCR SIZE 1 miRQP0227 hsmq-0031 MIMAT0000069 hsa-miR-16 75bp GeneCopoeia 2 miRQP0074 hsmq-0032 MIMAT0000422 hsa-miR-124 73bp GeneCopoeia 3 miRQP0096 hsmq-0034 MIMAT0000423 hsa-miR-125b 75bp GeneCopoeia 4 miRQP0175 hsmq-0035 MIMAT0000429 hsa-miR-137 76bp GeneCo

总RNA提取 具体步骤：（关键是防止RNA酶的污染） ⑴ 1) 称取-85℃冰冻保存的标本50-100mg，于液氮中夹碎(用剪刀将组织块剪成若干碎块)(须避免RNA酶的污染)。 2) 将组织碎块加入1ml TRI zol变性缓冲液中(所加组织块的体积不能超过TRIzol体积的10%)，在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止，研磨过程在0℃冰水中进行，以防止组织RNA被降解。 ⑵ RNA的分离 3) 然后将组织匀浆液转移到1.5ml的Eppendorf管中，室温静置5min，使核蛋白复合体完全分离。 4) 加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，充分摇匀15秒左右，配平，室温静置2-3min 。 5) 4℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)。此时可见液体分层：底层——红色酚-氯仿相；中间层——粉红色的交界相；上层——无色液相（RNA全部在此相中）。 ⑶ RNA的沉淀 6) RNA仅存于上清中。将上清转移至新管（1.5ml的Eppendorf管）中(切勿将中间层误吸入)， 7) 加入0.5ml的异丙醇，充分混匀，配平，室温静置10min。 8) 4℃冰冻离心机中离心(120

美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechology Information ,NCBI) 充分利用Internet ,为用户提供了丰富的生物信息资源。NCBI 的BLAST 程序是进行核酸序列和蛋白质序列相似性比较的优秀工具。 1 　BLAST简介 NCBIBLAST(Basic Local Alignment Search Tool ,局部对比基本检索工具) 是将核酸序列或蛋白质序列与可用的序列数据库进行相似性比较的一系列程序。其核心是程序BLAST210。BLAST是一个寻找序列间具有相似性的区段,进而比较它们之间结构和功能的工具,而不是仅仅比较整个序列的同源性。BLAST的应用范围相当广泛,适用于核酸或蛋白质序列与可用的序列数据库之间的比较,也可用于几个序列间的比较:核酸- 核酸、核酸- 蛋白质、蛋白质- 蛋白质之间。NCBI 的BLAST 提供了网页、电子邮件以及FTP 三种方式进行序列分析,使用十分方 便。 2 　各种BLAST介绍 BLAST经过不断发展完善,有以下几种类型: 2.1 Nucleotide BLAST Nucleotid

晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌中表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction system（pET系列质粒）的发明者。 T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株，染色体里面已经整合入了由LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG，来诱导T7 RNA polymerase的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什