今天我想跟大家分享关于肝细胞选择的一些技巧，希望大家的研发之路可以走的顺利一些，搞科研不容易啊。 1.如果你的实验室之前没有成功分离肝细胞的经验积累，建议大家还是不要尝试了，这个的确不太容易分离而且肝细胞的冷冻复苏里面有很多的技巧，一时半会儿很难掌握（我们有客户花了8个月的时间，最终还是失败了），因此如果自己分只会浪费更多的时间。 2. 如果经济条件许可最简单的就是选用贴壁肝细胞。贴壁肝细胞比悬浮肝细胞的质量更高具体表现在以下方面： A较少的细胞膜损伤； B可以延长使用时间： 悬浮肝细胞6个小时就会丧失活性，因此只能用于短期实验（以小时为单位）研究，比如药物摄取，代谢稳定性和代谢物性能分析。贴壁的肝细胞可以存活几天或者 几周的时间（大于7天），可以用于长期代谢研究、体外肝毒性研究、代谢依赖的药物毒性研究、实验依赖的抑制实验研究、酶诱导研究和外排转运体研究。 C高存活率: 通常情况>90% D高贴壁率: 将近100% E具有对CYP1A2, CYP2B6 和CYP3A4等酶的诱导性和反应性 F完整的摄取转运体和外排转运体活性 当然，如果控制成本就要考虑的细一些，如果只是做底

对于一些生物测序公司（ 如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢？ PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸 ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本

刚进实验室学技术 ，看到复旦大学某教授写的有关质粒的好文，贴在这里与大家共享（最后的问题也希望各位能解答一下：）： 从质粒抽提谈起 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技 术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生 却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实 验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后 来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这 个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为Ｄ

问题： 原因 解决办法 DNA完全没有被内切酶切割： 1) 内切酶失活 标准底物检测酶活性 2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 3) 条件不适（试剂、温度） 检查反应系统是否最佳 4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 6) DNA位点上存在其它修饰 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证 7) DNA不存在该酶识别顺序 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证 DNA切割不完全： 1) 内切酶活性下降 用5-10倍量过量消化 2) 内切酶稀释不正确 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3) DNA不纯，反应条件不佳 同上 4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰 同上 5) 部分DNA溶液粘在管壁上 反应前离心数秒 6) 内切酶

RNAi介绍 1. RNAi现象 RNA 干涉（或者叫做RNA干扰）指的是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。在一些生物系统中，少量拷贝的双链RNA能导致细胞内所有同源基因的降解。这个现象在进化过程中保守而且广泛，许多基因在这个过程中发挥了重要的作用。 人们发现这个现象在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。而在RNAi现象在线虫中发现之前，其机制被认为是一种转录后基因沉默，共抑制或者是压制，被认为是细胞防御中由双链RNA区域来区别和对抗病毒和不稳定的染色体部位。 由长链RNA发动的RNAi现象，中间体是一种小的干扰RNA，通常为21－23个碱基长。当人们尝试分离这样的SiRNA时才发现细胞基因组中有大量的类似小RNA的编码。这些小RNA，大约21－23个碱基长，被统一称作卫星RNA。（mirna） RNAi机制过程中首先被鉴定出来是一种被称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一种。Dicer能将长的双链RNA通过切割的方式降解为 SIRNA,也是在对70碱基的转录的未完成发卡结构降解成mirna的方式。卫星RNA随后被科研人员认

蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。 一、 新型蛋白标签 蛋白标签应用极为广泛，但仍有两个问题不容忽视：（1）蛋白标签以DNA形式编码，它需要转录并翻译成蛋白后才能发挥作用，而这种作用方式本身就是一种缺陷。例如，常用的荧光蛋白标签，在显微镜下观察时，其显像不如人工合成的荧光基团好，但是这种人工合成的荧光基团却无法通过遗传学操作与目的蛋白进行融合表达；（2）每一种标签一般只适用于一种用途，蛋白的纯化、检测、定位等往往需要不同的蛋白标签。对此问题有一种解决办法，那就是开发一种标签，使其再与各种人工合成的“二级标签”结合，例如荧光基团或亲和基团等等，以实现多种不同的应用。 现在已经出现了多种新型蛋白标签，它们都可以与一系列人工合成的配体形成共价键。这些配体包含两种关键结构：（1）反应连接体，即一个蛋白标签反应连接部位，其作用是启动与蛋白标签的共价键的形成；（2）功能报告体，即一个功能报告基团，如荧光染料或亲和反

在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中,都需要使用寡核苷酸作为探针或引物,而对这些反应的质量起最重要影响作用的,就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果,而用不够合适的寡核苷酸时,常常得出似是而非的结果,不仅大大增加了后续实验的工作量,还可能一无所获。 怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。 1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性 寡核苷酸,无论是DNA的或者RNA的,都有形成双链结构的潜在可能性,正如下面反复提到的,这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以,预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中,碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中,这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在,大多采用 Breslauer等人提出的,以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见,所有的计算都在25 ℃条件下进行。此时,最接近的相邻核苷酸的自由能是：第一个(5′)核苷酸 第二个核苷酸 dA dC dG dT dA -1.9 -1.3 -

小弟我这段时间因为实验需要,开始大量的提取脑组织的RNA.以前提取RNA都是做逆转录吊基因用,所以对于RNA的要求不算是特别严格.但是这次的实验要求RNA提取纯度和精度都比较高,所以对于RNA提取的结果也就比较关注. 在前一段时间我提取RNA中一个比较明显的问题是在28s的上面会多出一条带,当时在本版上面问了很多战友,也看了相关的贴,发现这是一个比较普遍的问题,对于这条带的解释有些战友说是基因组残余,有些战友说是蛋白残余.解决方法上,有些战友提出要增加Trizol的用量,有些战友建议酚氯仿多次抽提.由于我手头的样品量相对充裕,所以小弟作了一些对照实验,以摸索比较优化的条件.现在将结果向各位战友汇报一下,希望能够对大家的实验有所帮助, 同时也以此向本版的”上海孤儿”大哥致敬,谢谢他以前为大家提供的无私帮助. 实验条件如下: 组织样品: 灵长类脑组织 提取试剂: Trizol 实验环境: 提取RNA专用超净台,进口无RNA酶枪头,其它实验用品如试管架等用实验前用75%酒精擦拭. 试验设计：每一管中都用100mg组织 lane1 1ml trizol 2，lane2 1.2ml Tri

RNA提取和RT-PCR 在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。 真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。 所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 1．RNA的提取 RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 1．1 分离高

本人新手，刚接触到microRNA这一领域时，不知道如何下手。通过查阅相关文献，虽然对其有所了解，但也存在诸多困惑！且不说对各种miRNA的功能及作用机制知之甚少，单从最基本的miRNA的命名上看就很是费解，比如：hsa-miR-4720-3p 等应该如何理解呢？我想大多数刚接触到这方面的朋友们估计也跟我有一样的困惑吧？！通过收集各方面的资源，总算有了些收获，为以后在该领域的进一步研究打下了基础。在此分享给大家，希望对各位有所帮助！！！ 一、miRNA的定义 　　miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。 　　miRNA(microRNA)在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA(microRNA)大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA(microRNA)的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。 　　二、miRNA数据库 　　miRBase序列数据库是存储miRNA信

目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会 < language=Java1.1 src="/newsf/js/inpic.js"> 的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，以下是有关RNAi技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略，主要来自于《遗传》杂志2005年“RNA干涉（RNAi）技术应用于哺乳动物细胞的研究策略”，希望能给从事或者准备从事RNAi相关实验的研究人员以帮助。 一、靶siRNA序列选择 靶siRNAA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳动物细胞RNAi实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。 1. siRNA设计的原则 SiRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密码上游d0—100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3

刚在生物通网站上看见的东东，觉得很有用，就转贴过来。 一旦生物样品被收集采摘，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采 样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即运回实验室保存。对于实验者来说，无论是采样还是将样品取出以抽提RNA都非常不方便。QIAGEN公司最新推出的RNeasy Protect Kits提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即加入这种试剂，即可保护样品中的RNA完整而不被降解。在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18—25度保存7天，2—8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须

1. 影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素 在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达的降低程度（例如:基因阻断），包括： •　转染效率 •　目的基因转录效率 •　蛋白稳定性 •　选择特殊Stealth™RNA或者siRNA序列的效率　 •　选择哺乳动物细胞系的生长特征 当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为“Seven Steps Toward RNAi Success”的文献。随同Stealth™RNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（www.invitrogen.com）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。 2. siRNA的转染 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种： 1.）磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，

名 称 ADP 全名（英） adenosine diphosphate 全名（中） 二磷酸腺苷 含义 名 称 AG 全名（英） 8-azaguanine 全名（中） 氮杂鸟嘌呤 含义 名 称 AMP 全名（英） adenosine-5'-monphosphate 全名（中） 一磷酸腺苷 含义 名 称 AO 全名（英） acridine orange 全名（中） 吖啶橙 含义 名 称 APRT 全名（英） adenine phosphoribosyltran-sferase 全名（中） 腺嘌呤磷酸核糖转移酶 含义 名 称 APT 全名（英） aminopterin 全名（中） 氨基蝶呤 含义 名 称 ATCC 全名（英） American Tissue Culture Colection 全名（中） 美国组

溴化乙锭EB净化和处理方法 溴化乙锭EB净化和处理方法 EB是我们从事生命科学尤其是分子生物学经常要接触的致癌性物质,且不好处理.现提供如下方法,供参考. 特别是刚走进实验室未生育的新同行,一定得学会保护自己呵,否则还涉及到下一代问题 实验室中经常有EB被打翻或EB废弃物的处理问题，如何做到标准处理？ 1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。 2 废 EB溶液的处理方法 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时； b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3 废EB接触物，如抹布，枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。 由于EB是一种诱变剂，直接倒入水

总有同学分不清荧光与萤光的概念，导致犯了很低级的错误，例如有人问我，为什么我把pGL转染细胞，荧光显微镜下看不到荧光那？又比如 做双荧光素检测时能不能用酶标仪检测，或者该用什么仪器测那？这都是分不清荧光与萤光的区别导致的。本文只给刚入门的师弟师妹看，大神们不要笑话。 荧光，英文fluorescence，是指绿色荧光蛋白以及其变体（EGFP,CFP,ECFP,YFP,EYFP,DsRED等等）在收到激发后发射出的特定频率的光，这是一个生物物理反应，类似于我们高中物理学的什么基态啦，跃迁啦之类的那一块。这家伙是得了炸药奖的。Clontech公司构建了大量荧光定位质粒，如pEGFP-N1，pDsRed2-N1，pDsRed-Monomer-C1等等。 萤光，英文luminescence，即发光或称生物发光，是指萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶等在底物存在（实际上还需要ATP,氧，辅酶A等，这些试剂盒中已经加入）下发出的光，是生物化学反应，他的实质是酶，没有底物是不能发光的。把LUC利用的最好的是PROMEGA公司，他们有大量试剂盒是基于这两种荧光素酶的，最常见的是检测启动子或增强子活性的双荧

第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的

miRNA Northern Blot实验步骤 1975年，英国科学家埃德温·迈勒·萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）创建了Southern Blot技术用于检测DNA。基于同样的原理，1977年由斯坦福大学的James Alwine、David Kemp和George Stark开发出了用于检测RNA的Northern Blot技术，至今仍然是一种经典的RNA检测技术。 miRNA在不同组织中丰度变化大，例如，miR-133在骨骼肌中表达很高，在心肌中表达低，而在其它组织未检测到。在使用Northern Blot技术检测miRNA的时候，对检测灵敏度要求比较高。给大家推荐一种基于多生物素信号放大的高灵敏度miRNA Northern Blot技术：RNA样本经过凝胶电泳分离后，转移至膜上；目标miRNA的表达通过生物素标记探针进行检测；生物素标记探针包含miRNA互补序列和标签序列两个部分，互补序列与miRNA结合，标签序列则与多生物素信号放大分子结合，实现对低丰度miRNA分子的高灵敏度检测。具体实验步骤如下： 1、RNA样品制备 总RNA的提取可以采取现

荧光定量PCR技术研究进展 多聚酶联反应（PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于获取特定基因或基因片段及临床基因诊断等领域。早期最成功及普及的应用领域是获取某一目的基因，用于基因诊断有许多局限性，主要有两点，一是不能准确定量；二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术（FRET）就用于PCR定量后上述问题才得到较好的解决。本文综述目前国内外几种荧光定量PCR的原理及应用现状。 1.TaqMan TaqMan技术是PE公司开发的，目前已开始应用于基因检测。该技术的基本原理见图1。它利用了Taq酶的5’外切酶活性，合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5’端标记一个荧光分子，3’标记另一个荧光分子。其中3’端荧光分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光，因此正常情况下该探针检测不到的5’端荧光分子发出的荧光，只能检测到3’端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR产物（模板）时，该探针与模板结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割