我也是从网上收集过来的，仅供相关人员参考！ DIG标记的Northern杂交试验指导 一、 RNA提取 方法一、改良异硫氰酸胍提取法 试剂及其配制 异硫氰酸胍变性液： 贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。 工作液－在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为： 4mol/L异硫氰酸胍 25mol/L柠檬酸钠pH 7.0 0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl) 0.1mol/L巯基乙醇(2-ME) 其它溶液： 2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0) 水饱和酚（pH 3.5） 49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇 100%异丙醇 70%乙醇（用DEPC处理水配制） DEPC处理后高压灭菌水 试验程序 1．取0.5~1g左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉

核蛋白提取： （1）5 millions个离心收集 （2）弃上清，细胞沉淀重悬于1.5ml冰预冷的PBS缓冲液，4℃下2000 rpm离心5min。 （3）弃上清，沉淀重悬于500μl冰预冷的Buffer A离心收集，再悬于0.5 ml Buffer A。 （4）冰上放置10分钟，加入NP40使终浓度为0.5%，混匀后，轻摇20秒。 （5）4℃下1330×g离心15分钟得到细胞核。 （6）重悬于50µl Buffer B，于冰上强烈振荡15分钟，4℃下16300×g离心10分钟。 （7）吸取上清，为核蛋白提取物。 （8）马上进行EMSA实验。 探针制备： 用γ-32P-ATP及T4多核苷酸激酶对合成的转录因子结合和突变型寡核苷酸的两条互补链分别进行末端标记。20 µl反应总体积中，加寡核苷酸10 pmol，10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液2µl，γ-32P-ATP 3 pmol，T4多核苷酸激酶10 u，37 ℃反应45 min，再置于68 ℃ 10 min灭活。在离心管中加入退火反应液60 µl，互补配对的两条链的标记产物各20 µl，于95 ℃变性5min，缓慢降温，使末端标记的互补

复旦大学某教授写的有关质粒的好文，贴在这里与大家共享： 从质粒抽提谈起 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技 术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生 却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实 验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后 来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这 个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人 心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义 就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的 根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它 只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有 那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手

电转化 请教电转化 求助！电转化！！！！！！ 求助！电转化！！！！ 电转化！求助！ ［求助］关于电转化 关于电转化 请教 电转化TG1菌转化效率 急！ 球面对称设计在大肠杆菌JM109电穿孔转化优化试验中的应用 提取的质粒进行电转化的过程中怎样防止污染？？ 电转化,谁来帮我一下,现焦头烂额 求助：电转化仪器使用和实验步骤 枯草芽孢杆菌的电转化没有转化子，请指教！ 请问大肠杆菌能否用电转仪转化载体 [精华] SOS！电击转化老是失败！ 请问有没有师兄师姐做过电转化 化学转化 请教：关于连接转化 关于连接转化的问题 请教各位：这是转化的问题还是连接的问题？ 连接转化的问题 关于转化 请教转化 请教转化的问题 关于转化的问题，急！在线等 关于转化的紧急求助！！ 转化遇到的问题 转化出现这样得结果是什么原因,如何解决啦 [求助]转化不成功 转化老是不成功，各位大侠救救我吧 求助，奇怪的转化子！ 为什么我的转化子很少，而且蓝色菌落占绝大多数 求助：在PCR产物不多的情况下应该继续PCR还是做转化？ 请教！用PGEM-T ea

第四节 病毒载体携带的siRNA 介绍 在大多数真核细胞，RNAi是一个高度保守的机制，它被认为是基因表达和抗病毒机制的调节剂。1-4 RNAi是一个多级的过程，第一步是:在一种核糖核酸酶Ⅲ样的酶(Dicer5 )的作用下，双链RNA(dsRNA)被裂解成小干扰RNA(siRNA)。6这些21到23个核苷酸的siRNA随后参与构成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，可以将siRNA带到同源mRNA的地方，并将其破坏。 在2001年，Elbashir 等 发现用化学合成的长21个核苷酸的siRNA瞬时转染哺乳动物细胞，可以获得基因特异性抑制。这些siRNA的长度足以诱导产生基因特异性抑制，又不至于引起宿主的干扰反应。另外，siRNA也可以来自于含有茎环发夹结构的 dsRNA。这些短发夹RNA(shRNAS) 可以用含有RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子的质粒DNA在体外表达。9-14 接着shRNA被Dicer切割成siRNA，然后在胞浆参与构成RISC，降解mRNA。这些研究表明在哺乳动物细胞产生 si/shRNA是可行的。然而，沉默效果是短暂的，转染原代细胞效率相对较低。为了提高原代细

我以前做的实验都是通过感受态的转化方法来转化枯草芽孢杆菌的。 但是枯草芽孢杆菌的感受态转化效率比较低。 最近我采用电转化的方法，但是遇到了一个问题： 就是每次电击完毕后，加入复苏缓冲液37度复苏2h后，发现原来还混混的转化液竟然变得澄清了！涂布后一个转化子都没有！不知道是怎么回事？ 还有：垂悬菌体必须要温柔吗？我挺用力的，但不至于一个转化子都没有吧？ 质粒样品里面的RNA很多有没有影响啊？我的质粒RNA蛮多的。 质粒加多了是不是也会严重影响电转化效率啊？ 希望大家给看看，问题出在哪里？谢谢各位！！！ 附： 枯草芽孢杆菌电转化方案 1 感受态细胞的制备 1.1 从新鲜培养的平板上接种一单菌落至3 ml B2液体培养基中，试管（17×100 mm）。 1.2 250 rpm，37℃培养过夜（16 h）。 1.3 接种1.5 ml过夜培养的种子至150 ml（装于1L的三角瓶中）新鲜的B2培养基中，200 rpm，37℃培养，至菌数达到～1×108 cells/ml。 1.4 将菌液冰水浴15 min，然后转移至250 ml的离心杯中，12,000 g，5 min，4℃离心收集菌体

第三张“基因变异图谱”与第二代基因组测序技术 ——评“千人基因组计划”首期研究成果的医学意义 世界上任意两个人的基因99%都是相同的，而恰是那1%不同，负责着个体间的表型差异。《自然》杂志近期披露，当人体内携带有250到300基因变异位点的时候，相关基因就就会“沉默”。甚至，一个人只携带了 50到100基因变异位点，就可能患上某种疾病。 10年前，“人类基因组计划”这一耗资30亿美元、历时10余年的伟大科学工程完成之际，人们以为得到了揭开自身生命奥秘的天书，生命科学也划时代地进入了“后基因组时代”。如今看来，当时得到的仅仅是人类基因组的“参考图谱”，对于人群里个体间的基因差异，或是更具医学意义的“基因变异图谱”来说，人们知之甚少。 第三张“基因变异图谱” 为了探寻个体间的基因差异，科学界在2002年启动了HapMap（人类基因组单体型图谱）计划。Hapmap在2005年完成的“第一张基因变异图谱”含有一百万个“单核苷酸多态性”（SNPs）位点；HapMap在2008年完成的“第二张基因变异图谱”含有三百一十万个SNPs位点。而此次“千人基因组”所公布的一期结果——“第三张基因变异图谱”

骨髓细胞染色体标本的制备 一、原理 骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者，特别是慢性或急性粒细胞性白血病，因为骨髓反映粒系统细胞增生情况，这些病人不宜用外周血。即使是淋巴细胞性白血病，也不主张用外周血，因为加PHA刺激外周血培养，只能获得正常淋巴细胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴细胞的染色体改变。 骨髓细胞属不断增殖的细胞，培养可分短期培养和直接制片法，无论哪种其培养液中均不需加PHA。 二、用品和试剂 同外周血染色体制备。 三、操作步骤 （一）短期培养法 1．取材、培养：从髂骨取骨髓液0.2—0.5ml，无菌注入装有5ml培养液的培养瓶中，37℃培养23—25小时后，加入秋水仙碱（终浓度为0.07μg/ml），继续培养3—4小时，收获。 2．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同实验一。 （二）直接制备法 1．从髂骨抽取0.3—0.5ml，立即注入浓度为0.07μg/ml的秋水仙碱的生理盐水5ml中，以吸管轻轻吸动，将骨髓中脂肪颗粒充分吸掉，1000rpm离心8分钟，弃上清。 2．加入同样浓度的秋水仙碱生理盐水2—3ml，室温放置2—3小时，离心弃上清。 3．染色体制片：低渗、固定、

DNA分子标记、基因组作图及其在植物遗传育种上的应用(2) 发布日期：2003-2-16 22:17:00 作者： 出处：中国农网 b　SPARs(Single Primer Amplication Reactions)标记　通过采用基于微卫星或简单重复序列(SSR)的单一引物来扩增SSR之间的DNA序列(Gupta等，1994)。在二碱基，三碱基，四碱基和五碱基的简单重复顺序中，以四碱基的简单重复顺序最为有效。这些标记大多数散布于DNA序列中，它们多为显性表现，但也有些为共显性表现。 　　 c　SSR—锚定PCR(SSR—anchored PCR)标记　该标记是以二碱基简单重复序列，特别是CA，为引物来扩增产生的，锚定碱基为引物3’或5’端的2～4个碱基。所扩增的Inter-SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，这些扩增带多为显性表现。 　　 ②3’端具有选择性的双引物PCR标记 　　 AFLPs(Amplified Fragment Length Polymorphisms)标记　其原理是选择性扩增基因组DNA的双酶切片段(Zabeau等，1993)，它实际上是

Re:cDNA文库构建问题 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=729416 BAC文库构建完全手册,无私奉献!欢迎下载!!! http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=969664 这是我们常用的建基因组文库的流程，与大家分享。如有不足，尚请指正！ http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=895823 cDNA文库建库流程2.doc http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=895845 . 求助cDNA文库构建的问题 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1076855 请教ＣＤＮＡ文库构建中的相关问题 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=831097 请教:如何去除cDNA文库构建过程中rRNA的污染？ http://www.dxy.cn/bbs/post/v

这段时间在作实验,这篇文章我觉得特别好,现在拿出来和大家分享一下! 从质粒抽提谈起 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。每个曾经用碱法抽提过质粒朋友，希望你看本文后能有所收获。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达

一、 GFP背景概述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由Osamu Shimomura于1962年在水母（Aequorea victoria）（图2a）中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用（图3）。在Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮（图4）。 GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰（图5）。 GFP的晶体结构是由11个β-折叠组成的柱状结构，直径约3nm，长约4nm。柱中央有一个α-螺旋（图6），发色基团在α-螺旋上，非常靠近柱的中心（图4，图6）。蛋白

长期以来，肿瘤一直是严重威胁人类健康的重大疾病。目前，我国有恶性肿瘤患者约450万人，死亡率超过30%，而且每年新增的患者人数高达200万以上。然而，目前临床上治疗肿瘤的传统方法，如手术切除和放、化疗，对多数肿瘤的疗效有限，且始终未能彻底解决肿瘤复发和转移的问题，提示这些治疗手段很可能未靶向肿瘤发生发展的关键环节。新近的研究发现，部分肿瘤组织中存在少部分特殊细胞，被称为旁群细胞或SP细胞(side population cells)，这些细胞具有干细胞的很多特性，在肿瘤耐药和复发机制中可能起着关键作用[1]。越来越多的学者认为，若想治愈肿瘤，SP细胞应成为治疗的靶点。 一、SP细胞的发现 SP细胞最初是在造血组织中发现的。1996年Goodell等在研究鼠造血干细胞(hematopoietic stem cells HSCs)过程中，发现骨髓细胞被DNA荧光结合染料—烟酸己可碱33342(Hoechst 33342)染色后，经过流式细胞仪可以分离到一个新的细胞亚群，表型为CD34low/-, 这些细胞有独特的能力，能将染料迅速泵到细胞外，使细胞内烟酸己可碱含量很低，将其命名为SP细胞

:) [A-G] A 腺苷脱氨酶缺乏症Aadenosine deaminase deficiency (ADA) 定义：一种严重的免疫缺陷症，腺苷脱氨酶的缺乏可使T淋巴细胞因代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症（SCID）。通常导致婴儿出生几个月后死亡。 腺嘌呤Adenine (A) 定义：一种含氮碱基，是碱基对A-T（腺嘌呤-胸腺嘧啶）的一部分。 腺病毒adenovirus 定义：一组导致呼吸道疾病(包括常见的引起感冒)的DNA病毒。腺病毒基因组是36Kb的线性双链DNA，紧靠两边的是长100bp-165bp的末端重复，其含DNA复制起点和包装信号，腺病毒通过切去一些序列进行遗传改造，用于囊性纤维症、癌症和其他潜在疾病的基因治疗的载体。 Alagille综合症Alagille syndrome 定义：在婴儿和幼儿中发现的罕见的遗传性肝脏紊乱性疾病。这种疾病是以肝脏中正常胆管的缺乏和肝外胆管的狭窄而造成的肝脏中胆汁积累为特征。紊乱的症状包括黄疸、生长受阻、表皮脂肪堆积、面部畸形和心脏、眼睛、椎骨及肾的不正常等。 等位基因allele 定义：位于一对同源染

RNA干涉（RNAi） 1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。 在随后的短

重组质粒一月有余，颇有心得，与各位战友分享如下： 1：关于双酶切的Buffer，一直是酶切的重点。有人喜欢A酶切完回收再B酶切，其实可以通过NEB网站上查询大部分双酶共切的Buffer问题，常见的双酶搭配甚至可以找一本TAKARA或者其他公司的Catalog，内切酶部分在前面肯定就有双酶切的Buffer推荐表。有些酶没有搭配的推荐，但是有各种酶在L，M，H，K及T+BSA的相对活性，AB两酶选一个合适的即可。注意尤其是T+BSA是较为广泛的universial buffer,一般酶都能保持60%活力以上。但也有个别情况例如Sal I等，也是本人用过的酶，在T+BSA活性低于20%，与Sac I基本上没法在普通Buffer里切，但是可以查到1.5T+ BSA这种特殊Buffer，效果不错。另外如果载体MCS不是太老或者太少的话可以尝试某些同Buffer酶，不必死抠师兄或者文献做法，例如后来第二次用我就重新选了Cla I和EcoR系列，可共用H Buffer，并且Cla I活性是120%。 2：质粒酶切在一开始遇到问题，即试剂盒提取后切一个小时就降解完全，后来经过研究认为是洗脱液的问题，现

一、miRNA的定义　　miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。 　　miRNA(microRNA)在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA(microRNA)大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA(microRNA)的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。 　　二、miRNA数据库 　　miRBase序列数据库是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一，提供公布的miRNA(microRNA)序列及注释信息。目前miRBase(Release 18.0)记录了18226个miRNA(microRNA)。 　　三、miRNA名称与编号 　　1) miRNA(microRNA)成熟体命名规则(以动物miRNA为例) 　　①确定命名规则之前发现的miRNA(microRNA)，则保留原来名字，如hsa-let-7。 　　②miRNA(microRNA)成熟体简写成miR，

一、基因芯片： 1、基因芯片综合分析软件。 ArrayVision 7.0 一种功能强大的商业版基因芯片分析软件，不仅可以进行图像分析，还可以进行数据处理，方便protocol的管理功能强大，商业版正式版：6900美元。 Arraypro 4.0 Media Cybernetics公司的产品，该公司的gelpro, magepro一直以精确成为同类产品中的佼佼者，相信arraypro也不会差。 phoretix™ Array Nonlinear Dynamics公司的基因片综合分析软件。 J-express 挪威Bergen大学编写，是一个用JAVA语言写的应用程序，界面清晰漂亮，用来分析微矩阵（microarray）实验获得的基因表达数据，需要下载安装JAVA运行环境JRE1.2后(5.1M)后，才能运行。 2、 基因芯片阅读图像分析软件 ScanAlyze 2 ，斯坦福的基因芯片基因芯片阅读软件，进行微矩阵荧光图像分析，包括半自动定义格栅与像素点分析。输出为分隔的文本格式，可很容易地转化为任何数据库。 3、 基因芯片数据分析软件 Cluster 斯坦福的对大量微矩阵数据组进行各

今天老师让我找一些比苯酚氯仿抽提法更简单的方法。通过专利文献和杂志，发现了一些简单的方法。现小结一下---血清中病毒DNA的提取一 煮沸法从血清中提取病毒DNA，与其它方法比较，此法最为简单，并且很多文献都有报道 。鲁艳芹等在一篇名为《乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法及专用试剂盒》专利(专利申请号为200610044679)中对六种方法提取血清中乙型肝炎病毒DNA的效率做了比较，得出结果是：NaOH裂解法最佳，其次是直接煮沸法，但该法不适合提取粘稠度较高的血样标本。说明直接煮沸法还是可以的。另外，陈秀珍等人《采用不同方法提取血清及乳汁中HBV-DNA扩增结果分析》对抽提法、热处理、碱变性法提取乙肝标志物阳性出产妇血清及乳汁中HBV-DNA方法进行评价，发现血清标本HBV-DNA的提取，三种方法无明显差异。陈秀珍等：取血清100ul，放入0.5ulEP管中，沸水中煮10分钟，10000r/m,离心5分钟，取上清备用。专利：取血清100ul和100ulPBS，煮沸10分钟，12000rpm, 离心5分钟，取上清备用.两篇文章所用的煮沸法大致一样,只是是否加PBS的差异。加PBS，这样使得

题录集：静脉大容量快速注射siRNA或质粒 有些老师曾经认为通过小鼠尾静脉注射200微升质粒液体都很困难。而现在，小鼠尾静脉注射1.3毫升的siRNA或质粒已经快成了在整体动物水平快速鉴定某个基因功能的标准手段。这种大容量快速注射还可以用于兔子、狗等大型动物。 除了尾静脉是可以输入核酸的路径之外，还可以通过门静脉、肾静脉、下肢静脉等进行局部灌注。所以，以前用于反义核酸(ODN)的一些体内delivery手段，还可以拿来尝试用于RNAi的核酸输入。 ------------------------------------------------- 在啮齿类动物建立尾静脉大容量快速注射方法(也有译为“尾静脉液压注射法”)： 1. Liu F, Song Y, Liu D. 1999. Hydrodynamics-based Transfection in Animals by Systemic Administration of Plasmid DNA. Gene Therapy 6:1258-1266. 2. Zhang G, Budker V and Wolff JA. 199