中肽生化技术系列 Stapled Peptides 杭州中肽有限公司α-螺旋是蛋白二级结构最常见的一种，将其用于药物研发受到了大量关注。多肽的不稳定构象导致易被酶水解以及生物利用率低，这些都可以通过α-螺旋结构构象的稳定化来解决。Hydrocarbonstapled peptides是在特定位点引入化学交联的一种全烃化装订，将迷你蛋白锁定在他们的生物活性的α-螺旋构象中。多肽装订的理念是用于克服两大类治疗试剂的靶向细胞内蛋白相互作用的局限性：小分子和蛋白生物制剂。作为一类新兴的下一代药物，Stapled Peptide应该具备易于合成和容易进入细胞的能力，以及能够多靶标识别的生物活性。有两种构象化策略用于引入和稳定α-螺旋结构，即α双取代（甲基化螺旋骨架）和巨环桥形成（约束构象）。在多肽内装订从而使两个合适的空隔合并：α-甲基化，α-alkenylglycine残基，有确定的立体化学构象和烯烃链长度，然后在树脂上进行钌介导的烯烃复分解反应，从树脂上切割并去保护后便可产生Stapled Peptide。下图显示了在多肽中产生稳定α-螺旋的三种不同的全烃装订类型。α-甲基化和α-alke

FDA、SFDA对重组蛋白、vero细胞疫苗等生物制品的DNA残留均有严格要求，近年来包括大牌进口产品在内的狂犬疫苗DNA残留超标问题，引起了社会和业界的广泛关注。为什么一个看似简单的问题，却给众多专业人员带来如此大的困扰？一方面是由于DNA超强的化学稳定性，另一方面是由于DNA其带有大量的电荷易与其他生物大分子结合从而产生聚集（吸附）、包裹作用而难以完全除去。DNA的去除方法主要有层析、膜过滤、离心、沉淀、酶解等方法。这里对工业上应该最广泛和有效的离子交换层析、鱼精蛋白沉淀、酶解三类方法进行比较。1. 离子交换层析DNA带有大量的负电荷，可以被阴离子交换剂吸附而除去（或用阳离子交换剂负吸附）。离子交换层析在生物制品的生产中广泛使用，负载量大、成本低廉，尤其工艺中本身具有这些步骤的情况，不需单独增加去除DNA的步骤，通过控制吸附、洗脱条件，就能取得良好的去除DNA的效果。其缺点是在DNA残留要求较高的情况下难以达到。原因在于，当目标产物与DNA带有同种电荷时，分离较为困难；而当目标产物与DNA带相反电荷时，两者会发生聚集和包裹现象，影响去除效果。2. 鱼精蛋白沉淀鱼

关键词：标准物质 食品成分检测 化学试剂 分析试剂 一、双指示剂甲醛滴定法 1．原理 氨基酸具有酸性的一COOH基和碱性的一NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液 时一NH。基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定一COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。 2。试剂 ①40％中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂用氢氧化钠40％甲醛中和至淡蓝色。 ②0．1％百里酚酞乙醇溶液。 ③0．1％中性红50％乙醇溶液。 ④O．1mol·L-1氢氧化钠标准溶液，标定后使用。 3．操作步骤 移取含氨基酸约20～30 mg的样品溶液2份，分别置于250 mL锥形瓶中，各加50 mL蒸馏水，其中1份加人3滴中性红指示剂，用O．1mol·L-1氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20 mL，摇匀，静置1 min，用O．1mol·L-1，氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液体积。 4．

一：公司介绍 武汉明皓生物科技股份有限公司（http://www.moonbiochem.com）坐落于武汉东湖高新技术区光谷生物城, 是由一批在生命科学领域具有相当丰富经验的归国博士及经验丰富的专家共同创办的专业的生物公司。武汉明皓生物始终以“一切以客户为本”为理念，致力于为从事生命科学研究的科研人员提供高质量的化合物，多肽，蛋白及抗体产品以及高效优质的生物技术外包服务。 武汉明皓生物科技股份有限公司重在以高品质高质量为基础，以高满意度的客户服务为立命之本。我们坚信我们良好的发展前景和不断完善的经营模式，会为更多的客户提供更完美的,更贴心的服务。二：我们的专长（1）普通线性肽，链长至120个氨基酸，毫克至克级，纯度可达99%（2）简单修饰肽：免费提供N端乙酰化，末端酰胺化（3）C端：酰胺化（NH2），生物素标记 (用赖氨酸侧链连接)，PEG2(用赖氨酸侧链连接)， C-FITC(用赖氨酸侧链连接)，C-AMC N端：乙酰化（AC），生物素标记（Biotin），脂肪酸修饰(Pal, Myr)，罗丹明标记， N-FITC，N-5

本书有29章，全是英文，经翻译成中文，首次在此公开，就是说还未出过正式的中文版，请珍惜。 现将第1章放上，因内容太多，打成文本将超过千页，将会陆续放上，当然，首先是大家都喜欢！第1章 基因就是DNA早在一个世纪以前，孟德尔(Mendel)定义了基因的基本属性。在他的两个定律中将基因归纳为一种“特殊因子”。在它从亲代传给子代的过程中是不改变的。同一个基因可能以不同的形式存在（突变）。在二倍体的植物中，含有两个染色体组。每个子代从两个母代中各遗传到一组染色体。这同基因的行为相同。相当于发现染色体是基因的载体。下一步是证明每条染色体是由线性排列的基因组成。孟德尔定律预测不同染色体上的基因将各自独立分开。然而在同一染色体上的基因表现为连锁遗传。基础观察显示不同染色体上的基因是以随机重组的方式代代相传，然而连锁性基因重组的几率下降，就是说它们有在一起不分离的趋势。通过基因分析可以绘制出基因连锁图的结构，包含了1条染色体上携带的所有基因。连锁群的基因图与自然存在的染色体相一致。在二十世纪前五十年建立高等生物的遗传图。基因被组合成像一个带子上的珠子。它们出现在固定的位置上，基因的重组包括同

按一下步骤操作，连续两次均抽不出任何东西，请高手指点！ 抽提用作转染的重组质粒DNA(用5ml菌液) 所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System，能够去除对细胞有害的细菌内毒素。具体操作步骤如下： （1） 将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。 （2）加入250µl 重悬液，振荡至完全重悬。 （3）加入250µl细胞溶解液，颠倒离心管6～8次，彻底混匀。室温孵育5min。 （4）加入350µl中和液，立即颠倒离心管6～8次，彻底混匀。 （5）室温下10000×g离心细菌溶解产物20min，上清移至新的1.5 ml 离心管，再次离心20 min，将上清移至新离心管。 （6）彻底摇匀除内毒素树脂，加50µl到离心管中，室温孵育10 min，在孵育过程中每隔3 min剧烈振荡5 sec。 （7）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，吸

1)1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0) 组份浓度：1 M Tris-HCl 配制量：1 L 配制方法： 1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 PH值 浓HCl 7.4 约70ml 7.6 约60ml 8.0 约42ml 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 2)10×TE Buffer (pH7.4, 7.6, 8.0) 组份浓度：100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA 配制量：1 L 配制方法： 1. 量取下列溶液，置于1 L烧杯中。 1M Tris－HCl Buffer（PH7.4，7.6，8.0） 100ml 500mM EDTA(PH8.0) 20ml 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定容至1 L后，高温高压

在凝胶成像系统电脑上发现的东西。园里不没有。呵呵。 帖一个分享一下。 园里相关的方法还有： 酵母总RNA提取 [1] [2] mRNA的分离技巧 小麦总RNA的提取 验证有效的多酚类植物(苹果,棉花)提取RNA protocol RNA提取,欢迎对其细节进行交流 土壤DNA、RNA的提取 RNA 操作注意事项与实验技巧 操作注意事项： 　　由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功，请仔细阅读下列注意事项，相信它能帮助您解决常见的问题。 　　归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，必须做到以下几点： 1. 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。 2. 操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上

国家人类基因组北方研究中心 对外开展重组腺病毒构建包装服务 通过与美国Vector Biolab公司合作，国家人类基因组北方研究中心（北京诺赛基因组研究中心有限公司）利用优越的实验条件和训练有素的科研人员，成功构建的一个集克隆、包装、扩增、纯化为一体的重组腺病毒构建技术平台。从2005年7月成立腺病毒小组并开展实验至今，为课题组内部完成包装200多个腺病毒，为Vector Biolab公司成功包装近300个腺病毒，并且进入美国市场。 本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架的复制缺陷型重组腺病毒系统，通过对比其他系统（包括Adeasy、Adeno-X、AdMax等系统），对穿梭载体，病毒骨架载体和包装细胞系都做了改进，并做了大量的实验和重复验证工作后，使得该系统比上述系统有了更强大的优势，可提供高品质、高产量的重组腺病毒。并且在克隆、包装、扩增、纯化、滴度测定等各步条件也做了改进和优化，达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上，还拓展了更广泛的应用，可以提供各种带报告基因的（如GFP、RFP、Luciferase、LacZ等），带不

全基因表达谱差异研究有这些方法，EST测序（成本巨大）、DDPCR（特异性差，基本已经不用）、基因芯片（技术上比较复杂，数据处理工作量大）、SAGE技术（相对较科学，实验数据较可靠、花费较大）等。 个人推荐：（本人原创，请斑竹加一分表示鼓励） cDNA-AFLP是从AFLP (amplified fragment length polymorphism) 衍生而来的RNA指纹识别技术，现已发展成较为成熟的转录组研究技术（Donson, et al., 2002），运用该技术可从转录水平鉴定mRNA差异从而阐明基因调控在RNA水平的表现。在此之前，鉴定和克隆差异表达基因（Differentially Expressed gene）的方法有RAP-PCR（RNA-fingerprinting by arbitrarily primed PCR，Welsh et al., 1992）和差异展示技术（DD/RT-PCR，Liang, 1992）等RNA指纹识别技术，但是，由于这些方法得出的实验结果存在高的“假阳性”、重复性差和难于检测低丰度表达的mRNA等缺点，所以经常要改进引物设计或者结合

看到这篇文章，非常的详细，和大家分享一下。 由于内容比较多，编辑不是很方便，也上传了附件供大家下载。如果觉得有帮助记得投票或者顶贴哦！ 基因芯片 1什么是基因芯片 生物芯片，简单地说就是在一块指甲大小（1cm3）的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等）将生物分子探针（寡核苷酸片段或基因片段）以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子（如基因）相互作用，交行反应的固相表面，在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征，CCD相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号，作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片

原位杂交的教程及问题分析,可以帮助分析杂交试验失败的原因. 目录 第一节 原位核酸分子杂交技术的发展? 第二节 原位杂交技术的基本方法? (一)固定? (二)玻片和组织切片的处理? (三)杂交? (四)杂交后处理? (五)显示? (六)对照实验和结果的判断? 第三节 原位DNA和DNA分子杂交方法? (一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法? (二)生物素标记HPV-DNA探针在石蜡切片上检测HPV-DNA的方法? 第四节 RNA原位核酸杂交方法 一、基本原理 二、 RNA原位杂交中探针 (一)探针种类 (二)探针标记 (三)探针的纯化 (四)杂交前准备 (五)杂交前探针的选择 三、 cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交 (一)组织的前处理 (二)RNA探针的标记 (三)预杂交 (四)原位杂交 (五)杂交后处理 (六)杂交后显色 四、用寡核苷酸探针检测组织中的 RNA原位杂交 (一)组织的前处理 (二)杂交预处理 (三)寡核苷酸探针选择和标记 (四)预杂交 (五)杂交 (六)杂交后处理 (七)免疫检测及显色 (八)阳性信号的评定 (九)原位杂交的对照 五

完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1),提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2),直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 方法一:总RNA的试剂盒快速提取 一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RN

到医院实习之前，我有幸跟随我的恩师，利用课余时间做了两年多的基础科研。从不懂规矩到渐入佳境，期间学习了很多东西，在此感谢我的恩师！ 我们是生物化学教研室，这两年的时间里我做了很多生化方面的实验。像细菌培养、细胞培养、PCR、western-blot、MTT测细胞增殖能力，这些实验都有商品化的试剂和推荐的操作方法，做起来，难度并不大。唯独让我感到苦恼的就是ShRNA表达质粒的构建这部分，它耗费了我们很多的精力，虽然最终取得了成功，也发表了论文。但是显然，这个实验的可重复性并不理想。 我一共做过四五个重组质粒，其中插入片段，大的有2000bp左右的，小的也有200bp左右的。其中200bp~900bp的不大不小的片段相对好做，2000bp的难度相对较大。而其中最难做的恐怕就是ShRNA表达质粒了，RNAi技术这些年是一个热点，但是把一个只有63bp的小片断DNA插入到4000bp~5000bp的质粒DNA当中，并不是一件容易的事情。期间我们做了近百次的尝试，总结出这么一些经验： 1、质粒酶切方式的选择。现在看来，如果质粒的条件允许，最好选择双酶切。因为双酶切操作相对简单，而分步酶切需

第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的

最近做了四次电转化，两次成功转化率大于10的9次方，效果非常好 ；另从两次失败转化率吸取了教训；现将试验方案及操作与大家共享： 1.细菌电转化感受态细胞的制备 （方案由李芃同学提供，lzf继承补充） 1）由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落，过夜培养16－20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜，转速控制在180rpm。 2）第二天，取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基（1：200）的500mL摇瓶中，37℃剧烈振荡 （300rpm）培养至OD600约为0.72-0.76，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷。 3）用两个预冷的50ml离心管于4℃ 2000g离心10分钟。收集菌体，弃上清。 4）用预冷的水（纯净双蒸水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃ 2200g离心10分钟，弃上清。 5）再用10%甘油重复步骤4）两次，2400g离心10分钟，最后一次倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100ul/支（一般，25ml起始培养物最终用200-250uL10%甘油悬浮）。 6）

RNA提取的流毒非浅的经典误区（初学者的必看贴） 最近碰到了好几个RNA提取的初学者来实验室学习如何提取RNA，对于如此简单的操作，却有如此多的人提取不出来，细问一下，原来他们的知识来源都是书本上或者网上的“RNA提取注意事项一类”的所谓经验，其实，他们提取不出来的真正原因，恰恰是他们严格遵守了所谓的经验，精力全放在不需要注意的地方，结果搞得自己很紧张， 真正需要注意的操作反而没有注意了。下面我就结合生物通上常见的RNA 操作注意事项与实验技巧的文章 （http://www.ebiotrade.com/newsf/2004-3/B2004312163158.htm）指出提取RNA的流毒非浅的常见误区： 1．“ 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。” 完全错误，任何普通的试验台，不需要任何消毒，暴露在空气中就可以。用我的话说就是垃圾堆里面我都可以提取出RNA!有的学生告诉我他们在哪里提取的， 他们在超净台里面操作，只有两个孔伸手进去，操作及其不便，还容易使人疲劳，风干RNA沉淀的时候，也看不清楚，常常造成要么干过

随着核酸疫苗和基因治疗的迅速发展，高纯度的，符合药物动力学的质粒DNA的需求越来越大，本人准备的论文综述初稿，对目前大规模进行质粒DNA生产的流程有一些初步见解，与大家一起探讨。 ====================================================== 综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展 一、质粒DNA 细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的 遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子[1]，质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2]，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3]。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子[4]。 用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5]，为了获得高稳定性、高产量

gateway技术近两年开辟了高效克窿 转载新方法，特转载一篇于大家共赏，也欢迎更详细资料. GATEWAYTM克隆中基因看上去是什么样的？ 基因两端应该有att位点，在Entry克隆中是att L序列（100bp），而在表达克隆中是att B序列（25bp）[Hartley, J. L., Temple, G. F., 和Brasch, M. A. (2000) Gen. Res. 101788.]。在att位点间的所有序列会和你的基因一起移动。因此，你必须预先决定是否包含诸如真核或原核翻译信号，或3'终止编码等DNA元件。 我能克隆多大的片段？ 对于PCR产物，我们已经克隆从100bp到10kb大小片段的同时，LR反应已经用于操作130kb大小的目标载体。 最小的片段是什么？ 我们相应必定有一个最小尺寸，可以是由于重组反应的拓扑结构所限制的。早期数据显示，位点间有7bp片段就足够了。 我怎样利用这一系统？ PCR是最容易的方法。扩增你的基

外周血培养基配制 一、配制用水 培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。 二、培养基 培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。 三、血清 培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。 四、抗菌素 为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升。 五、植物血凝素（PHA） 非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过