第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的

快速的操作，低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。 分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧 提取RNA所用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1％DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会 A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤 B.您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时

如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！ 1.PCR产物的酶切。 PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料: PCR产物的酶切相关的帖子： http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/242899_1.html http://www.dxy.cn/bbs/thread/818980 http://www.dxy.cn/bbs/thread/620693 http://www.dxy.cn/bbs/thread/720799 2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑： （1）酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题

提供给新手，希望对各位战友有帮助，多多参与核酸技术版的讨论！引物篇1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以

miRNA是一种重要的非编码RNA，调控至少 30% 以上的基因表达，参与多种生理病理过程。2011年4月27日，Sanger microRNA序列数据库(miRBase)升级至17.0版。在新版本中，发夹前体序列升至16769条，新增1597条；成熟miR和miR*产物共19724条，新增2383条；新版本报道序列共涵盖153个物种。目前已公布的人成熟microRNA为1711个，还有大量预测的microRNA基因需要通过实验验证。关于miRNA的研究涉及肿瘤及其它疾病病理、免疫学、发育生物学以及应用miRNA诊断治疗等多种领域，是当前生物学研究的热点之一。 由于miRNA仅仅有18-23个核苷酸构成，在研究方法上与通常大家熟悉的ｍRNA有所不同，特别是在miRNA提取、逆转录和荧光定量PCR等方面差异较大。现受丁香园邀请，特设立此miRNA实验技术答疑专帖，将对丁香园的站友们提出的miRNA相关问题（包括实验设计、样品准备、实验技术、后续分析等问题）给予解答，也希望有经验的战友一起讨论，共同学习，共同提高。对于答疑热情高，水平高的战友，欧易生物将给予鼓励，奖品为爱国者迈凯轮高

基因组信息学 陈润生 (中科院生物物理研究所，北京100101) 当前人类基因组研究已进入了“功能基因组”阶段，即将发挥出巨大的社会效益与经济效益。科学家相信生物信息学将在这一研究中起着越来越关键的作用。生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，在获得了蛋白质编码区的信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测，然后依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计。因此基因组信息学、蛋白质的结构模拟以及药物设计就构成了生物信息学的三个最重要的组成部分。近年来，随着人类基因组计划(HGP)在世界范围内的开展，破译人类及多种模式生物的遗传密码已成为生物学领域的带头学科。与此同时产生了巨量的基因组信息。分析这些信息是人类基因组研究必不可少的重要内容，并且也带动了整个生物信息学的发展。由于蛋白质结构模拟和药物设计已有大量评述性文章发表，本文主要介绍基因组信息学。 一、基因组信息学的含义 在美国人类基因组计划的第一个公开文本中，对基因组信息学的含义曾有过这样描述：它是一个学科领域，包含着基因组信息的获取、处理、存储、分配、分析和解释的所有方面。具体来说、就是要构建适合于基因组研究的数据库，发展有效的包

在园中看到有些战友对质粒提取的问题有些误解。现把我找到的关于质粒提取的原理列在下面，希望对大家有所帮助。 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑

RNAi实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced

1．目的 学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。 2．原理 限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。 3．器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。 4．试剂 电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液，DNA分子量标准（DL2000），DNA凝胶回收试剂盒。 5．实验准备 配制TAE电泳缓冲液（10´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）； 6．操作步骤 （1）用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。 （2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA酶切产物，电泳。 （3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在

RNAi在药物最佳靶点筛选和鉴定中的应用 摘要 最佳药物靶点的筛选和鉴定是新药研发的核心，是药物开发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。在过去十年里，科学界已经在此领域做出了巨大的提高，如：基因组学和蛋白质组学以及人类基因序列的测定，而且在制药工业的投资不断加大。然而新药研发受到多因素调节、单因素之间相互作用等复杂药物调节机制的制约，临床上药物疗效还涉及到药物代谢以及药物的毒副作用。因此急需能够加速和提高精确性的靶点筛选技术。最近才发展起来的RNA干扰（RNAi）技术已经成为一种强有力的筛选药物靶点和鉴定药物靶点的工具，这种方法能够有效高选择性地分解靶点的mRNA，基于此法引起的表型功能丢失可以确定相应蛋白质的功能。将此技术与高通量筛选、试管内生物分析以及活体疾病模型结合应用，提供了有效的检测基因功能的方法，这些技术的联合应用，将有效地提高药物靶点的筛选及鉴定。本文将介绍近年来RNAi技术在药物靶点筛选及鉴定的方法及取得的成就。 关键词 药物靶点，RNAi，高通量筛选。 简介 药物靶点的筛选和鉴定是耗资巨大的过程，证明疾病与大量基因中某个调节基因编码蛋白质的亚单

做RNAi的战友可以先学习学习了。 1、PTGS 转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing）一种首先在植物中确定，然后发现在动物中也存在的现象。尽管PTGS最初被描述作一种病毒防御和转位子沉默的内源方法，现在它已经成为一种新的令人激动的研究工具――RNA干扰。 2、协同抑制（Cosuppression） 基因沉默的一种特殊情况，来源于转基因的RNA与同源内源基因同时被抑制。 3、静息作用（Quelling） 用于在粉色面包霉菌（Neurospora crassa）中描述协同共抑制。这个术语仅仅用来在真菌中描述沉默。 4、dsRNA 双链RNA（Double-stranded RNA）通常指长的或者全长的RNA双链。这些大的dsRNA在大多数哺乳动物细胞类型中全面启动宿主细胞的关闭（shutdown）；随后细胞开始降低非靶标基因的表达，最终经历凋亡（apoptosis）。 5、RISC RNA诱导沉默复合体 （RNA-induced silencing complex）即所推测的多蛋白复合物，将siRNA和细胞内mRNA结合到一起，

打开峰图文件，依据图形初步判定测序质量，SAP酶纯化后的头峰杂度比较大，至少前50bp序列一般不可信，后续峰形如果还不错，主峰高、噪峰低、未见干扰峰，测序结果应该可信。一个正常的成功反应，能保证测序峰形清晰的长度为500 Bases (实际600 —800 Bases)。 在进行DNA测序时，紧接引物的10 — 30 Bases有时不一定能完全读清楚。 由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/C rich; G/C Cluster；Poly A、 Poly T的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下： 1： 测序结果有很多套峰，出现很多N值原因分析：PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。 在序列的起始端出现N值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。模版本身含杂合序列，有等位基因。 2：为什么找不到我的PCR引物序列？用P

1．电转化感受态细胞的制备 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。 5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。 6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感

“分子克隆”第三版有下面两段话： DNA 和 RNA 纯制品的 OD260:OD280 值分别是 1.8 和 2.0，若样品中蛋白或酚的污染较严重，则 OD260:OD280 低于上述两个数值 (p1695 倒数第 5 行)。水饱和酚在 270nm 处有特征性吸收，其 OD260:OD280 比值为 2 (p1697 的框内倒数第 2 行)。 当时看到时就觉得这两段话是矛盾的；翻看英文版，发现没有翻译上的错误。难道真的会出现这样的现象：在 OD260:OD280 比值为 1.8 的纯 DNA 中加入比值为 2 的水饱和酚，则比值会小于 1.8？试图找原文 (Stulnig and Amberger 1994)，没有找到，所以自己用水饱和苯酚测。 以水做对照，测定含少量水饱和苯酚的 OD 值，结果如下：A230 = 0.024, A260 = 0.045, A270 = 0.070, A280 = 0.035；A270:A280 = 2，A260:A280 = 1.29，A270:A260 = 1.56，A260:A230 = 1.88。该实验证明：水饱和酚在 270nm 处有特征

RNA 干扰是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi实验所需的4大要素一点不复杂： 1对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）； 2适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法； 3适当的对照； 4检测目标基因表达情况的方法 1. 对应目标基因的dsRNA 在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，这些小分子RNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RNA-induced silencing complexes，RISCs)，并引导RISCs结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA， 从而导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见下图：线路1，蓝色 对于哺乳动物细胞来说，导入30bp以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗

siRNA构建 siRNA 质粒载体的构建 RNA 小片段可以通过化学合成或质粒载体转录获得。质粒载体的构建是将长约70bp的含有特定茎环以及终止信号的DNA分子插入到特定载体中，该DNA分子可以 在细胞中转录为含有特定发夹结构的RNA双链分子。这些发夹RNA分子在细胞中被切割为19-23nt的双链RNA小片段，从而起到抑制特定基因表达的作用。 siRNA 质粒载体的优点 与化学合成siRNA相比，siRNA 质粒载体有以下优点： 1. siRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达。 2. 更加稳定和易控制。 3. 可以用于稳定的细胞系建立。 4. 可以用于诱变系统的建立。 5. 可以建立基因敲除的小鼠模型。 6. 含有GFP的载体可以用于监测转染效率。 7. 可以源源不断的提供siRNA。 8. 成本低廉。 缺点是：siRNA质粒载体的构建有一点难度，而且需要花费一定的时间。Realgene为您提供完善的siRNA质粒载体构建服务，详情请联系Realgene. siRNA服务介绍 基于载体的siRNA技术 ---包括siRNA 靶序列设计、载体选择和质粒构建等全方位服务 Real

来源：生物通 第二代测序技术, 又称新一代测序技术, 是相应于以Sanger 测序法为代表的第一代测序技术而得名。第二代测序中3种主流测序技术分别为依次出现的 Roche/454 焦磷酸测序(2005 年)、Illumina/Solexa 聚合酶合成测序(2006 年)和 ABI/SOLiD 连接酶测序(2007 年)技术。与 Sanger测序相比, 3种新一代测序技术共有的突出特征是, 单次运行(run)产出序列数据量大, 故而又被通称为高通量测序技术。 　　深圳华大基因研究院是国内外高通量测序技术应用方面的翘楚，近期其相关研究人员以“高通量测序技术在动植物研究领域中的应用”为题，就高通量测序技术应用于动植物基因组学和功能基因组学研究进展进行了系统阐述, 并对当前高通量测序技术的现状和热点及未来的发展趋势作了深入剖析和讨论。 　　这篇文章从多个方面入手，包括全基因组de novo测序、全基因组重测序、简化基因组测序、转录组测序、数字基因表达谱技术、小RNAs 测序、降解组测序和基于测序的表观基因组学技术，内容详细具体。 　　其中关于全基因组重测序，研究人员介绍了6个方面：核心

随着人类基因组（测序）计划（Human genome project）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。 基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片）技术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。早在八十年代，Bains W.等人[1]就将短的DNA片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入[2]。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时

如何确认RNA的质量 提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！ 以下两种方法，相信大家都知道的： 1）检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。 1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RN

1溶液配制: 1.1 Buffer P1:(悬浮用) 成分：50mM Tris.HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 100ug/mL Rnase A 配制： 2M Tris.HCl, pH 8.0 25mL 0.5M EDTA, pH 8.0 20mL 双蒸水至 1L，灭菌。 使用前每1L buffer加入100mg RNAse A，并于4℃保存。 1.2 Buffer P2：（裂解用） 成分：200mM NaOH, 1% SDS 配制： 8g NaOH固体溶解于500mL双蒸水中，成0.4M NaOH溶液 10g SDS溶于500mL双蒸水中，成2% SDS溶液 使用前将上述两种溶液等体积混合后使用 注意： Buffer P2混合后不宜放置时间过场，每次配够一周使用的即可。长时间放置容易产生沉淀。若有沉淀产生，在37℃保温一段时间使沉淀溶解。 1.3 Buffer P3：（中和用） 成分：3M KAc（醋酸钾），pH4.8 配制：将147g KAc 溶于350mL双蒸水中，用约60mL冰醋酸调节PH值，然后继续用浓