第一章 色谱法概论 1 第一节 色谱法发展简史 1 第二节 色谱法中的一些术语 3 第三节 色谱法的分类 3 一 、根据分离的原理不同进行分类 3 二 、根据流动相的不同进行分类 4 三 、根据支持物的装填方式分类 5 第四节 不同色谱法的应用范围 5 第五节 色谱图的一些术语 6 第二章 蛋白质液相色谱纯化概论 6 第一节 蛋白质纯化的一般目标和方法 6 第二节 液相色谱纯化前的预备工作 7 一 、样品的稳定性实验 7 二 、样品的预处理及保存 7 三 、评价每一纯化步骤： 9 第三节 蛋白质色谱纯化技术理论简介 9 一 、可以用于分离的目的蛋白性质 9 二 、蛋白质的来源 10 三 、常用色谱技术原理简介 10 第一章 色谱法概论 第一节 色谱法发展简史 色谱法(chromatography)又称为层析法、色层分离法。早在1906年，俄国植物学家M. Tswett在研究植物叶绿素时发现不同的色素可被CaCO3吸附，并在用石油醚洗脱时得到分离，这是最原始的液-固色谱法。 但在此后的30年中，Tswett的方法并未得到人们的注意，直到1931年R.

一次认为最无望的化学转化，结果长出70多个转化子。分析原因，有以下几点不同于以往的做法： 我认为关键不同点是以下的2、3、4、6点，但没时间和精力去验证，希望大家给点指示。 1、 质粒酶切与乙醇沉淀等操作比平时长，都大于12h。 2、 乙醇37℃挥发3h，当时怕时间过长质粒降解了。 3、 热激之前的保温和热激温度都比平时高2-3℃，怀疑温度计坏了，歪打正着。以前有次转化长出40多个，温度比较恒定。这次温度又高又不恒定，由此可以排除温度是否恒定不是关键因素。 4、 做感受态时蒸馏水洗涤，由于不做转化有一段时间了，洗涤用水是平时的2倍。 5、 MD培养把108℃×35min错用成121℃×20min，结果MD中的葡萄糖有点焦化，颜色比平时偏深。但这次转化没受影响，感觉培养基不是关键因素，以前没加微量元素的MD板转化子也能生长很好。（第1次转化吸取PEG用200ul枪，应该用1000ul的大枪，吸取量不够，也长出10个转化子，感觉PEG的作用也不是关键因素） 6、 感受态不一样，转接之前的酵母菌菌密度合适，而且放置3-4天。放置1个week，转接转化，只长出3个转化子。以前转接之前

蛋白质构象病 周剑涛 ( 黄冈卫生学校生化教研室，湖北黄州 438000 ) 关键词：构象病；朊病毒；抑丝酶；β-淀粉样蛋白 中图分类号：Q51；R373 蛋白质结构生物学既从蛋白质一级结构序列，也从蛋白质空间结构及其动态变化去研究蛋白质的性质和功能。生物医学研究表明蛋白质空间构象发生异常变化会引起疾病发生，形成了蛋白质构象病(Protein conformational diseases)这一新的病理学概念[1]。 1. 蛋白质构象病及其分子构象病理学 一般讲，引起构象疾病的蛋白质分子与正常蛋白质同时存在于机体内，至少部分蛋白质具有正常折叠的空间构象，并以正常形态释放。当蛋白质构象异常变化时可导致其生物功能丧失，或者引起其后发生的蛋白质聚集与沉积，使组织结构出现病理性改变。 1.1 蛋白质分子纤维化与聚集 (1)血红蛋白(Hb) 红细胞内Hb分子构象异常改变，可致镰形红细胞性贫血、不稳定血红蛋白包含体溶血和药源性包含体溶血。镰形红细胞性贫血由异常HbS引起。HbS中珠蛋白二条β链N末端第6位Glu被疏水性Val取代。在低氧张力下，脱氧HbS因分子表面的疏水或静电作用，分子构象改

56邮箱bio_inf@56.com Quote: 一、生物学中文资料 医学统计软件使用 617.32Kb 数学模型有关知识资料库 4039.87Kb 人工神经网络导论 4075.21Kb 分子克隆及RNA干扰 5198.56Kb 中国草地重要有毒植物_史志诚 29508.91Kb 中国油脂植物 20914.90Kb 分子生物学实验帮助文档 234.57Kb 蛋白质分离纯化指导教材 5084.90Kb 基因工程原理与方法 14456.65Kb 微生物资源开发利用 10561.88Kb 蛋白质电泳实验技术 10375.14Kb 应用微生物学实验法 11911.36Kb 基因工程学原理 12801.99Kb RNAi原理动画演示 52.32Kb 分子生物学(特纳） 11452.88Kb 基因克隆和DNA分析（第4版） 8443.96Kb 细胞生物学教程 6253.92Kb 基因组学、蛋白质组学和生物信息学图片1. 33315.46Kb 基因组学、蛋白质组学和生物信息学图片2. 15145.24Kb 蛋白质结构、分类及预测 5426.98Kb 基因芯片分析的理论与方法 4744.54Kb

物理性质预测： Compute PI/MW http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/pi-tool.html Peptidemass http://expaxy.hcuge.ch/sprot/peptide-mass.html TGREASE ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/ SAPS http://ulrec3.unil.ch/software/SAPS_form.html 基于组成的蛋白质识别预测 AACompIdent http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/aacompi.html AACompSim http://expaxy.hcuge.ch/ch2d/aacsim.html PROPSEARCH http://www.embl-heidelberg.de/prs.html 二级结构和折叠类预测 nnpredict http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredictPredictprotein http://www.embl-heidelberg.de/predictp

因为自己实验后期需要使用这方面的技术,所以最近在查阅这方面的资料,想拿出来和大家一起分享.后期会把更详细的东西贴出来.英文水平一般,所以翻译的有点差,请海涵. Rac1 Activation Assay Kit被设计来鉴定贴壁细胞或非贴壁细胞的细胞裂解液中Rac活性数量(i.e. Rac-GTP, rather than the inactive Rac-GDP). 使用的glutathione (GST) pull-down方法，采用GST-agarose beads与有的包含74-89 个氨基酸的N末端调节区的部分p21-activated kinase (PAK-1)相结合。PAK-1的这个区域,被认为是p21偶联区域即P21binding domain (PBD),特异性的与活性形式的Rac1相作用,最终提供了一个优秀的工具以分离细胞样本中的活性Rac1. 细胞被镁盐缓冲溶液（ magnesium lysis buffer)所裂解; 接着裂解液需要采用GST-agarose beads (not provided)进行预清除.在这一步，少量的细胞裂解液能够储存起来以检测蛋白的

什么是转录因子？ l 转录因子（Transcription factor，TF）是一类能与特异性DNA序列结合并调节基因转录的调控蛋白。 l 转录因子通常是细胞内信号通路的核心蛋白，是将外界刺激转化为基因表达变化的关键调控者。 为什么要研究转录因子？ l 人体的35000多个基因在不同的组织、不同的时间具有表达差异性，转录因子的调控起到重要的作用。 l 2012年的诺贝尔生理学或医学奖得主山中伸弥，在小鼠成纤维细胞中表达Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4四种转录因子，将成纤维细胞逆转形成多能干细胞（iPS）。 l 转录因子与多种人类重大疾病相关，比如p53、myc、ER、Id与癌症相关；MEF2、HIF1与心脏疾病相关；NFκB与炎症相关；PPAR与肥胖相关等等。 怎样用转录因子研究为论文加“分”？ 加“分”Step1 l 信号通路以及疾病相关的研究比较容易找到转录因子研究的突破口，已有在研项目的研究人员根据自身的研究背景，找准转录因子研究突破口。 l 对于还没有具体研究思路的科研人员来说，转录因子研究相对来说容易出结果、容易发文章，也容易进行深入地探

胶上酶切方法 1． 用1.5mm3切胶笔切下胶点，置于96孔板或1.5ml Appendorf试管中。 2． 用50ul双蒸水洗2次，每次10分钟（如用1.5ml试管, 则用500ul）。 3． 加考染胶色液（50mM NH4HCO3/CH3CN(1:1)）50ul，超声脱色5分钟或37℃ 20分钟，吸干。（若为银染胶点，可以不脱色，也可以加15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3轻摇至变为淡黄色透明，再用水反复洗至无色）。 4． 重复步骤３，至蓝色褪去。 5． 加CH3CN 50ul脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。 6． 加10mM DTT（25mM NH4HCO3）20ul，56℃水浴1小时。 7． 冷至室温，吸干，快速加50mM IAA（25mM NH4HCO3）20ul，置于暗室45min。 8． 依次用下列溶液进行超声或混悬清洗: 25mM NH4HCO3（2次）、25mM NH4HCO3+50%CH3CN（2次）、CH3CN(1次),每次10分钟。CH3CN 脱水至胶粒变白，真空抽干10分钟。 9． 将0.1ug/ul酶液用25mM NH4

如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+ ＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l ＃P/E 启动子/增强子l ＃Termsl 终止信号 ＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素

蛋白质复性 史晋辉 (天津大学化工学院生物化工系，天津 300072) 关键词：蛋白质复性；环糊精；分子伴侣 重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径。但人们在分离纯化基因工程表达产物时却遇到了意想不到的困难：很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人γ-干扰素等，不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1～3.0μm的固体颗粒棗包含体［1］。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其立体结构是错误的，所以没有生物活性。因此，为获得天然状态的目标产物，必须在分离回收包含体后，溶解包含体并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性。这就向生物化学家的蛋白质折叠机制研究提出了新课题。 1. 蛋白质复性机制研究 分离包含体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包含体后，加入变性剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低。究

蛋白组学----ITRAQ技术简述 1994年，Marc Wilkins在Siena双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophoresis杂志上发表。随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，人们不再满足于对一个细胞或组织的蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量的研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛的应用。 蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein）与基因组学（genomics）两个词的组合体，表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表达的绝大多数蛋白质或一个复杂的混合体系中绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定。 蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的

PTD介导的蛋白质转导技术及其在神经系统 疾病治疗中的应用 生理状态下，真核生物细胞膜仅对少量小分子具有通透性，大大限制了生物大分子药物对疾病的治疗。由于转基因技术可操作性差、转运效率低、具有潜在的生物毒性作用、并且并非所有细胞均能被转染等缺点，限制了其实际应用[1]。PTD介导的蛋白质转导技术则使大分子蛋白质或多肽自由通透细胞膜成为可能，随之产生疾病蛋白质治疗技术。本文就这一技术及其在神经系统疾病治疗中的意义作一综述。 1.蛋白质转导域(protein transduction domain，PTD)： 又称为细胞穿膜多肽(cell-penetrating peptides, CPP)，是一类能够介导与之相连的多肽或者全长蛋白质穿过生物膜进入细胞的多肽结构，最初是发现于HIV病毒转录因子Tat蛋白中。目前已发现多种含有PTD的蛋白质，主要有以下几种： 1)HIV病毒Tat蛋白：是病毒复制后期所必需的转录调控因子，全长86个氨基酸。Mann 和Schwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57氨基酸(YGRKKRRQRRR) [2]。 2)单纯疱疹病毒(HSV)VP22蛋白

一般性网站 生物谷 http://www.bioon.com 中国生物论坛 www.biooo.com 丁香园论坛 http://www.dxy.cn/bbs/ 西陆生物探索者 http://www.bioprober.xilubbs.com （西陆）全文数据库检索论坛 http://ttpp.xilubbs.com/ 21世纪生物论坛 http://www.bio21st.com/ 中国生物论坛 http://www.biooo.com/ Bio-Engine论坛 www.bio-engine.com:8080/bbs/cgi- ... p;BypassCookie=true 明白读书论坛 http://mingbai.xilubbs.com/ 网上读书园地 http://readfree.cz98.net/club/index.asp 37℃医学网 http://www.37c.com.cn/ 中国材料网讨论区 http://bbs.chimeb.edu.cn/ 生命玄机BBS http://bbs.cst.sh.cn/ BioSino BBS http://www.biosino

翻译调控——连接基因组学和蛋白质组学的有效手段 摘要：在细胞内，蛋白质水平和mRNA水平是不一致吻合的。对蛋白质合成的 调控不仅局限于转录过程，翻译阶段也有一部分调节作用，mRNA的水平不能完全代表蛋白质水平。应用蛋白质双向电泳等方法分离蛋白质存在许多缺点，因此，利用蔗糖密度梯度离心的方法研究在翻译过程中的蛋白质调控是有意义的。只有核糖体结合的mRNA才可以翻译成蛋白质，而游离的mRNA在翻译中不起作用。 关键词 翻译调控 基因组学 蛋白质组学 随着人类基因组草图的完成，人们发现人类基因比蛋白质数量要少得多，只有3~4万个基因，而每个基因都可以编码1~8个蛋白质。酵母哺乳动物细胞分析表明，基因转录的mRNA水平并不能完全可靠的代表其相应蛋白质的丰度。这种mRNA水平和蛋白质丰度之间的差别揭示：除了在转录过程中，在蛋白质合成的其他阶段也存在调控机制。翻译调控（translational control）在控制基因表达方面起重要作用，实际上用翻译的mRNA描述蛋白质组比用总mRNA表述转录水平要准确得多。这将使基因组学和蛋白质组学最终联系起来。 在细胞内，是蛋白质而不是基因或其转录

摘要: 蛋白质组研究目的在于从蛋白水平阐明基因的功能，这对于探索生命的奥秘具有重要的意义。蛋白质芯片是近年来兴起的一种强有力的高通量研究方法，能够一次平行分析成千上万的蛋白样品， 具有很高的敏感度与准确性。它将成为蛋白质组学研究中的强有力的研究方法，并最终架起基因组学与蛋白质组学的桥梁。 1 　研究现状 蛋白质组(proteome)是指一个基因，一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域: ①蛋白质的大规模的分离与鉴定，以及它们的表达后修饰; ②蛋白水平的差异显示在疾病中的运用;③运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。 与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期，不同条件下，其蛋白质表达也不同 。虽然可以通过cDNA 芯片等方法显示生物体的基因启动状况，但mRNA水平(包括mRNA 的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手

实验室常用有毒药品 请大家使用时注意安全，取用有毒药品时戴手套，并注意再触碰其他无毒的物品时摘掉手套，以免污染。污染的手套如若立即再用，请有毒面向上并妥善放置。 0.溴化乙锭（EB）：大家都比较熟悉了。具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。。 1.DEPC(焦碳酸二乙酯):闻起来香香甜甜的,可是害人不眨眼!一种强有力的蛋白质变性剂,而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你,内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套,穿工作服,并在化学通风橱里进行. 2.PMSF(苯甲基磺酰氟):老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜,眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入,咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜,始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下,要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤,已污染的工作服丢弃掉. 3.乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 4.放线菌素D，是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 5.alpha-鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性，可能致命。 6.NN-亚甲双丙烯酰胺，有毒，影响中枢神经系统，切

由于本人刚刚进入实验室，没有任何经验，不知道各位大哥能否给于指导，告知具体的实验注意点。谢谢各位大侠 Cx43、Cx40蛋白表达的测定 2.6.1血管组织的匀浆 取血管标本100mg置玻璃匀浆器中，按100mg/ml的比例加入裂解缓冲液，4℃下手工碾磨10-15分钟至肉眼看不到组织碎片，置离心管中于4℃低温离心机以14000ram离心15分钟，取上清液分装保存在-70℃深低温冰箱备用。 2.6.2 蛋白浓度的测定 用Bradford 比色法测定，分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15，和20ul），以0.15mmol/L NaCl 补足至100ul。同时以两管100ul的0.15mol/L NaCl作空白对照管，每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，遮挡混匀，室温放置2min，用1cm光经的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白作图，画出标准曲线，回归系数R必须大于0.99，然后测量待测样本A595，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度，样本浓度过高则在稀释后再测定。 结果如下： 血清白蛋白 （ul） 5 10 15 20 0.15mmol/

1 分离方法 　　采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。 　　1.1 高效液相色谱（HPLC） 　　HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。 　　1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC） 　　结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成

整理了一下2006年1月份蛋白版的无人应助贴，以支持版主的工作. 这个月可能很多高手回家了，感觉无人应助贴比较多啊！希望大家积极应助啊！ 已被锁、被扣分、标题为空以及不符合发贴格式的无人应助贴不在此列 应助战友请到积分申诉区给出链接，谢谢 [求助]尿蛋白电泳 SDS-PAGE技术 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5252925&sty=1&tpg=46&age=0 [求助]如何研究作用在某启动子的反式作用因子呢 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5255960&sty=1&tpg=46&age=0 [求助]大家介绍一款分析蛋白质相互作用的软件好吗？ http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5262676&sty=1&tpg=46&age=0 [求助]小蛋白降解问题 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid

在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？ 知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。 真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核