前几天看到loveyingzi 在PCR技术讨论版有一个旧贴子。 [我快急死了,用细菌16SrRNA通用的引物扩增兔附红细胞体,结果测了2次序都不是,第一次测出来是葡萄球菌,第二次测出来是木糖氧化无色杆菌,可我对提基因组用的菌液镜检,还有划板培养都没发现污染的杂菌,面临毕业的问题,高手快快帮忙,谢谢.急!急!急!如果测序不出差错的话,那我提基因组肯定有问题,请问有谁提过附红细胞体的基因组?] 我是一名普通的兽医(E-mail: ydfyfdquam@163.com)，了解过一点附红细胞体。首先，loveyingzi选择研究的兔作为附红细胞体的研究动物，可能不妥。虽然我国于1981年晋希民教授就发现了家兔的附红细胞体，可是那毕竟是形态学的观测。随着最近十几年的分子生物学的发现，很多学者都以16SrRNA的基因序列来作为原核生物的鉴定基因，并且国内外的学者相继报导了多种动物体内扩增出的附红细胞体的16SrRNA基因序列，但是NCBI还没有收录免附红细胞体的16SrRNA基因序列（人或鸡的好象也没有收录）。如果真的能够扩增出来，那是世界首次报道，一定可以发SCI论文了。不过也不是没有可能，发

碱裂解法抽提质粒原理 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3M醋酸钾 / 2 M醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，★加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。 那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：★抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨

测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。 一、 试剂准备 １． 硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。 ２． 6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，

Stormstar Real Time PCR Master Mix SYBR GREEN Stormstar SybrGreen PCR Master Mix 产品名称 Stormstar SybrGreen qPCR Master Mix 价 格 说明书 DBI-2143 200 Reaction 2400元 DBI-2144 1000 Reaction 11800元 DBI-2173 40 Reaction 500元 ●

简并引物设计实际操作步骤 启因生物 一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。 二、对所找到的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其结果入下图所示,所有序列的共有部分将会显示出来。“”表示保守，“：”表示次保守。 三、确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保

条条大路通罗马，纯化之路千万条。本篇是写给蛋白质纯化新手的，就一些最常用的纯化工艺、概念方法作一些列举。以起始原料的不同来进行分类，分为：大肠杆菌、酵母、细胞培养、腹水、血清、生物组织六个板块。一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为 10g 左右。二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是 SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液 A 破菌时是在破菌沉淀中

最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。从园子里也学到不少。一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正:) 1. 首先介绍一下背景。载体是novagen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。 2. 第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR，酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了。失败了。曾在园子求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。 教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。 3. 第二次失败。后来重新构建，转化，诱导。第一次诱导时根本就没带。见附图（图片质量太差了，sorry，下面几个帖会逐渐好转。我们都在失败中提高，进步，不是吗:)） 然后开始找闷头原因。周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午

个人整理 Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面） 1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。 4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HC

开始做酵母双杂交了，计划用一个膜蛋白去筛库，已经做好了工作量大，而预期结果要靠点小运气的心理准备，面前真是一条很长的路要走！ 在丁香园学习了很久，希望能将我这次试验过程中遇到的困难和思索记录下来，跟大家一同讨论，共同学习。 今天先说说实验之前的试剂准备，为了保证实验能顺利进行，我选择了clontech的matchmaker gold系统，订购了人脑cDNA文库（标准化的），还有培养基也是订的商品化的，再有一个提酵母质粒的KIT 1，GOLD系统式对系统3的升级版，替换了一个报告基因，新加入了一种新的真菌抗生素，可能叫金担子素A吧，降低了平板的背景，和假阳性结果。 另外系统自带了一个转化酵母的试剂盒。 2，人脑cDNA文库，标准化的意思是降低了很多管家基因的表达水平，这样一来库内的各种基因表达水平比较均等，我是这样理解的，这个文库一共5支，每支1ml，每筛一次就要用去一支，还是很珍贵的。打了85折下来，也要10000块左右。 3，培养基用的很快，但是因为第一次接触酵母，为了保险起见，也咬牙买了 这么多的前期准备，花了大概25000的样子，都是打了85折 直接找clontech的北京代

喜欢转贴的，请注明来自中国生命科学第一网：丁香园。 根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。 1.载体构建错误。 这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。 2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。见下图 3.密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。但是有一点我可以有很大

1． Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能： a) 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列。b) 按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物。 c) 对环型DNA片段，设计反向PCR引物。d) 设计多重PCR引物。e) 为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现。f) 分析和评价用其他途径设计的引物是否合理。 g) 同源序列查找，并根据同源区设计引物。h) 增强了的引物/探针搜寻手段。设计引物过程中，可以“Lock”每个参数，如Tm值范围和引物3’端的稳定性等。 i) 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。 网址： http://www.oligo.net/ 2． Vector NTI Suite是一套功能最全，而且界面最美观，最友好的分子生物学应用软件包。主要包括四个大型软件，它们分别可以对DNA、RNA、蛋白质分子进行各种分析和操作。 Vector⑴ NTI：作为Vector NTI Suite的核心组成部分，它可以在生物研究的全过

不是我自己整理的，但是我觉得很不错 转载 from ccebbs 友情建议：crtl+F 先搜索你所需要的资源，不然眼睛都花了 前面是书名，后面是共享邮箱名 1 Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical... 2006.01.15 16:30 14082.65Kb hwzgj-chem,hwzgj-chem2 dragen 2 [坎贝尔骨科配套手术录相]01关节镜下使用..　2006.01.01 11:49　10845.83Kb ang616630 3 [坎贝尔骨科配套手术录相]01关节镜下使用..　2006.01.01 11:49　1282.29Kb ang616630 4 [坎贝尔骨科配套手术录相]01关节镜下使用..　2006.01.01 11:49　459.68Kb ang616630 5 [科学].Science.Magazine(.May.27.2005-... simonzg 6 “十一五”药物制剂开发思路　2006.01.20 14:11　902.07Kb hwzgj-phar,hwzgj-phar2,hwzgj-phar3 hjh

1. 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么区别？ 　　选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。 western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。 2. 没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？ 不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。 3. 做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？ 　　最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果

原核表达研究者关心的10个问题 (3) pET 是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。经pET系统过与使用过和正在使用这个系统的科学家的交流，我们发现了一些在使用pET系统的过程中以及原核表达中的一些常见问题。在此，我们选取了其中一些比较有代表性的问题，附上我们的建议改进方案，并期待和你一起分享成功的喜悦。 7. 如果IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？ T7 RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。 8. E. coli会去除成熟蛋白N-端的甲硫氨酸吗？这种加工对目的蛋白的稳定性有何影响？ N-端fMet是否被去除受倒数第二个氨基酸影响。这个加工过程由甲硫氨酸氨基肽酶催化，并受以下关系支配：去除的困难程度随倒数第

以下为有关于gst的帖子，供大家参阅： 大肠杆菌表达的GST和人的GST有同源性么 http://www.dxy.cn/bbs/thread/402809 如何去除GST融合蛋白以外的GST的表达？ http://www.dxy.cn/bbs/thread/711228 请教GST蛋白的纯化 http://www.dxy.cn/bbs/thread/585739 GST pull down http://www.dxy.cn/bbs/thread/496138 GST融合蛋白 http://www.dxy.cn/bbs/thread/632544 求助:GST http://www.dxy.cn/bbs/thread/530111 有关GST融合蛋白的纯化问题 http://www.dxy.cn/bbs/thread/298420 GST过柱纯化问题 http://www.dxy.cn/bbs/thread/158122 请教有关GST fusion protein的实验方法 http://www.dxy.cn/bbs/thread/137894 讨论：GST-融合

1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做 western blot 实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot 实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam 品种全，质量过硬，但价高（3400 元/100 微升），而且说是 100 微升，但至多能吸出来 90 微升；Sigma 的价最贵；比较有性价比的是 CST 的抗体，现在好像是2200 元/100 微升，我前后用过二十几种， 1:1000 的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和 western blot 实验，还有一个优点是通常量比 100 微升多出来 10 微升，唯一的不足是 CST的品种实在不多。Santa 的多克隆抗体质量可以，但是选用 Santa 的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420 元/ 100微升），大概好抗体的比例约为 50%，如果能做

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鉴于原核表达的两大热门系统，his tag系统和gst系统，从园子里归纳出以下帖子，以方便大家参考。 这是关于his tag的讨论贴 蛋白纯化高手请指点（his） http://www.dxy.cn/bbs/thread/276543 请问哪位做过6-His蛋白？ http://www.dxy.cn/bbs/thread/36760 his融合表达问题！再问载体！ http://www.dxy.cn/bbs/thread/633019 his-tag标签纯化？？？ http://www.dxy.cn/bbs/thread/238044 SDS-PAGE电泳 HIS系统非变性纯化 单抗制备技术支持 http://www.dxy.cn/bbs/thread/537283 Ni柱鳌合纯化His-融合蛋白出现凝集求助 http://www.dxy.cn/bbs/thread/173220 过HIS柱后表达蛋白分子量变了！！！ http://www.dxy.cn/bbs/thread/433678 6－his标记蛋白的对纯化和功能研究的影响 http://www.dxy.cn/

很多战友（包括我）对“复杂”的生物学软件和厚厚的软件使用说明书充满了恐惧，以至于始终不能够用它们来提高自己的工作效率。很多不太懂电脑的战友就是被这些复杂的东西吓得永远不敢去用软件的。我们做StepByStep的初衷就是让初学者按图索骥地几分钟之内就学会怎么用一个生物学软件，而更进一步的功能可以在使用中自己去慢慢摸索。 StepByStep的中心思想： ++++几分钟，一个例子学会一个软件的基本使用！++++ 目标读者：生命科学各个专业，对计算机尤其是软件不很熟悉的朋友。只起到一个迅速领进门的作用。 我们的计划是： 凝胶分析Bandscan5.0、质粒绘图Plasmid draw、引物设计DNAStar、序列分析[比对-对付测序报告，酶切位点分析]DNAssist1.0、蛋白质分析[提供物化参数、抗原性、二级结构预测，helix, sheet预测，同源性比较]Antheprot4.5、统计绘图Origin7.5、文献管理EndNote7这几个东西。其实还有其它很好的软件，只是我习惯于用这些，我们可以介绍不同的软件，比如EndNote7.0和RM10.0,比如其他很常用的如PP5.0

离心原理　当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。 此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。 离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ˉ，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。它们的关系是：F＝ˉ2R 为方便起见，F常用相对离心力也就