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(交流)免疫凝集试验方法-间接凝集反应

间接凝集反应 l 间接血凝反应 致敏红细胞的制备: 直接法: 1.取10%双醛固定的红细胞悬液1ml,离心沉淀后,将压积细胞悬于0.1mol/L、pH4.0醋酸缓冲液5ml中。 2.预温后加含适量致敏抗体的醋酸缓冲液5ml,混匀,放37℃20~30min或24℃ 60~75min,其间摇动数次,但不宜剧烈和频繁摇动,以免引起自凝。 3.最后用0.11mol、pH7.2 PB洗3次。 4.洗涤后的致敏红细胞用保存液配成10%悬液4℃保存或冻干。临用前,用实验中所用血清稀释液配成0.5%浓度。 间接法1:鞣酸法 1.取压积红细胞0.5ml,加0.15mol/L pH7.2 PB至100ml,加入0.05g/L鞣酸液100ml,混匀,放置37℃ 10min。 2.离心沉淀后,用同一缓冲液洗3次,重悬于生理盐水100ml中。加等量含适量抗原(或抗体)的同一缓冲液,置室温致敏10min。 3.离心沉淀用1:250稀释的正常家兔血清洗涤后,制成0.5%的致敏红细胞悬液。 间接法2:戊二醛一步法 1.将绵羊或人“O”型红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗3次,取沉

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【进展|热点】TLR1/TLR2 Agonist Induces Tumor Regression by Reciprocal Modulation of Effector and Regulator

JI:淋巴细胞的“杀癌”和“护癌”机制研究有新突破 近日,复旦大学上海医学院免疫学系储以微教授课题组经3年潜心研究发现,有一种从细菌中提取的名叫“BLP”的细菌脂蛋白,一旦与存在于T淋巴细胞表面的TLR-2受体“一对一配接”后,可以调动一群具有杀伤性T淋巴细胞明显增强其杀伤癌细胞的能力,同时,这种“一对一配接”还可以削弱和抑制另外一群调节性T淋巴细胞“保护癌细胞”的能力。这一新发现为恶性肿瘤治疗提供的传统放化疗法以外的副作用更小、专一性更强、更有效的免疫“生物治疗”奠定了坚实的基础。” T淋巴细胞是一种免疫细胞,在罹患恶性肿瘤时,它们中有的会发挥作用,奋力杀伤肿瘤细胞,但是,也有的T淋巴细胞非但不去杀伤肿瘤细胞,并且还会阻止其他淋巴细胞杀伤癌细胞。因此,如何调动“良性”杀伤性T淋巴细胞勇猛杀“癌”的积极性,并有效抑制“恶性”调节性T淋巴细胞的破坏作用,一直是国内外医学界科学家希望探索的“奥秘”。 储以微教授课题组经研究发现,“BLP” 细菌脂蛋白与存在于T淋巴细胞表面的TLR-2受体“一对一配接”后,会在两群T淋巴细胞中诱导两条不同的信号。对“良性”的杀伤性T淋巴细胞来说,激

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【共享】单克隆抗体制备常见问题及其解决方式

一、免疫失败的可能原因及应采取的措施 有时不能获得满意的抗血清,可从下列几方面找原因,并改进之。 1、免疫动物的种属及品系是否合适,可考虑改变动物的种属或品系,或扩大免疫动物的数量。 2、抗原质量是否良好,可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号,也可考虑改变抗原分子的部分结构,或改进提取方法。 一、免疫失败的可能原因及应采取的措施 有时不能获得满意的抗血清,可从下列几方面找原因,并改进之。 1、免疫动物的种属及品系是否合适,可考虑改变动物的种属或品系,或扩大免疫动物的数量。 2、抗原质量是否良好,可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号,也可考虑改变抗原分子的部分结构,或改进提取方法。 3、制备的免疫原是否符合要求,可从偶联剂,载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑,并加以改进。 4、所用的佐剂是否合适,乳化是否完全,可改用其它佐剂,或加强乳化。 5、免疫的方法、剂量,加强免疫的间隔时间和次数,免疫的途径是否合适。 6、动物的饲养是否得当,如营养(饲料、饮水)、环境卫生(通风、采光、温度)是否符合要求,动物的健康情况是否良好等。 二、制备单克隆抗体影

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【共享】读书笔记粘膜免疫系统

粘膜免疫系统(Mucosal Immune system)是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺体处的淋巴组织,是执行局部特异性免疫功能的主要场所。 粘膜免疫系统在结构和功能上均有别于传统的系统免疫系统,主要表现在以下几个方面: (1)MIS是大量免疫细胞和免疫分子弥散在粘膜上皮内或粘膜下固有层(弥散淋巴组织),或由单个或多个淋巴滤泡聚集成的粘膜相关淋巴组织(mucosal assacoated lymphoid tissues),包括肠相关淋巴组织(GALT)、支气管相关淋巴组织(BALT)和鼻相关淋巴组织(BALT)等。机体50%以上的淋巴组织和80%以上的免疫细胞集中于粘膜免疫系统。 (2)MIS分泌的是一类粘膜相关的免疫球蛋白,即分泌型IgA和sIgM (3)MIS内有一类能下调全身免疫应答的效应性细胞。 (4)按功能不同可分为两个部位:诱导部位和效应部位。前者主要指MALT,后者主要包括固有层、上皮内淋巴细胞和一些相关的外分泌腺(如泪腺、唾液腺和乳腺等)。 (5)在诱导部位和效应部位间,主要通过淋巴细胞归巢发生联系。即在一个诱导部位致敏的免疫

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(讨论)液相芯片资料

请认真阅读本版的《重要通知》,将帖子规入最相近的子版中。 请合作,否则扣分警告! Luminex™100 Liquid Array液相芯片分析平台 Luminex™100是一个多功能的液相芯片分析平台,通常用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究。Luminex™100有机地整和了有色微球(color-coded microsphere or bead)、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则,造就了Luminex™100无与伦比的检测特异性和灵敏度。微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的,调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球,每种颜色的微球可以携带一种生物探针。探针通过羧基结合到微球表面,因此一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。Luminex™100通过鉴定微球的颜色来确定反应类型,而对反应的定量分析是通过靶物质上的报告分子完成的。 Luminex™100液相芯片分析平台 实验流程 ☆ 将探针包被的beads、报告分子以及样本混合,静置一段时间 ☆ 将混合物上样到Luminex 100,采用微流技术将beads分为

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【共享】单克隆抗体制备

单克隆抗体的制备过程 单克隆抗体在现代生物医学中的作用越来越大,它不仅被广泛应用于生化和免疫检测,而且治疗癌症和自体免疫疾病的单抗药物也逐渐批准上市。因此单抗的制备和筛选具有其内在的重要性。 动物免疫 取4只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原(20 μg/只),第一次免疫与等量弗氏完全佐剂乳化,0.2 mL/只;两周后进行第二次免疫,抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化,皮下注射,0.2 mL/只;两周后进行第三次免疫,免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后,小鼠眼眶采血测其效价,第三次免疫两周后,选择效价最高的小鼠,用不加佐剂的抗原加强免疫,3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。 细胞融合 1、骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的SP2/0细胞,覆盖瓶底80%时弃上清,以不完全培养基洗涤一次后,用l0 mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。 2、脾淋巴细胞的准备 取加强免疫后3天的小鼠,摘除眼球采血作为阳性血清;颈脱臼将小鼠致死,用75%酒精消毒体表10 min,随即放入超净台内的解剖板上,腹部朝上,四肢固定;无菌打开腹腔取出脾脏,用基础培养基洗涤,并仔细去掉周

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real-time PCR 的超全应用解析

多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术发明至今已近 20 年了,在这期间技术得到了不断的发展,近年来出现的实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了 PCR 从定性到定量的飞跃,它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具,本文就此技术及其应用做一综述。1 实时荧光定量 PCR 技术的方法学1.1 原理所谓 real-time Q-PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在 90 年代早期,Taq DNA 多聚酶的 5′ 核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测 PCR 产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致 real-time Q-PCR

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Trizol 法提取RNA实验步骤

Trizol 法提取RNA实验步骤 需要的试剂: 氯仿 异丙醇 75%乙醇(in DEPC-treated water) RNase free水或者0.5% SDS溶液 [准备不含RNase的水,将其装入不含RNase的玻璃瓶中,加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。静置过夜,然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水] 1、组织匀浆 (1) 取出高温高压消毒后研钵,切取50-100mg冰冻组织置于研钵内,倒入液氮,研碎。 (2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL,标本的量不能超过TRIZOL体积的10%,否则会出现DNA污染。 (3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中,在15- 30°C放置5分钟,以彻底分离核蛋白复合体。 2、相分离 加入0.2 ml的氯仿,加盖好后用手剧烈摇晃15秒,在15- 30°C放置2-3分钟,然后离心 12,000× g,15 minutes , 2 - 8°C。离心后分成三层,下面的红色为酚-氯仿相,一个中间层,一面是无色的水相。RNA

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【共享】有关抗体的保存

不同类型抗体的保存指南, 用以避免抗体污染或损伤请不时核查数据表以获取特定保存建议。如果恰当保存和处理, 大多数抗体应能保持活性数月乃至数年。 保存温度和条件 对于很多抗体而言, 分装成小等份并冻存于 -20℃ 或-80℃ 是最佳保存条件。分装成小等份可最大程度减少由冻融造成的损伤, 以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次, 如有剩余, 可将剩余物保存于 4℃。在收到抗体时,在 10,000 × g 下离心20 秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液, 并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10μl;等份越小, 储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。 在大多数情况下, 抗体时在 4℃ 下保存一至两周, 然后再冷冻进行长期保存是可接受的, 但也许腹水液是例外, 它可能包含蛋白酶, 因而应该尽快冻存。同样, 遵照数据表上的建议是重要的。 酶偶联抗体不应冻存, 而应保存于 4℃。冻融不仅影响抗体结合能力, 还会降低酶活性。 无论偶联至荧光染料、酶还是生物素, 偶联抗体都应保存于深色试剂瓶中或用

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PCR 相关技术问题汇总

1.钓基因的过程中的问题http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=426195&sty=1&tpg=8&age=02.PCR 的方法作 STR 的分型http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=632509&sty=1&tpg=8&age=03.RNA 酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=640125&sty=1&tpg=8&age=04.关于扩增 cDNA 的 5UTR 的解决办法http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=641779&sty=1&tpg=7&age=05.扩 CDNA 的 3’ 端http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=266115&sty=1&

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【旧贴整理】SSCP检测SNP原理,步骤及常见问题总结整理

SSCP原理:sscp称为单链构象多态性,它是基于DNA构象来检测PCR产物单链碱基微小差异的方法,因其检测敏感,快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用。但该方法的试验结果受多种因素的影响,如:PCR产物,温度,电压,PAGE胶的浓度和交联度等,因而重复性比较差。因此在做SSCP时要注意各种条件的一致性。如果有酶切位点的话最好用RFLP方法检测DNA 多态,或是用SSCP与RFLP两种方法相结合,试验结果要更加可靠些。 SSCP的主要试验步骤: 1. PCR扩增目的基因片段。 2. 制备PAGE(聚丙烯酰胺)胶。不同长度的基因片段用不同浓度和交联度的胶,常用 的有19:1,29:1,39:1(丙烯酰胺:甲叉),浓度有8%,10%,12%的。 3. PAGE胶的灌制。将配好的PAGE胶混匀,立即灌至干净的玻璃板中,插上梳子于室温聚合1-2小时。 4. PCR产物的变性及电泳。取1-2ulPCR产物加5ul变性缓冲液,95度水浴或放置PCR仪上变性10分钟,立即拿出冰浴,迅速上样于非变性的PAGE胶,以1×TBE作缓冲液,在一定温度下电泳。根据待测片段的长度调整电压和电泳时间。

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Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等酶的特点及应用

合理选择耐热DNA聚合酶是PCR成败与否的一个关键因素。选择最合适的耐热聚合酶,是进行PCR实验首先要考虑的问题。许多耐热DNA聚合酶的主要区别在于特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。下面是六种不同耐热聚合酶的比较:Taq:扩增效率最高的耐热DNA聚合酶,能很好的扩增6kb以下的DNA 片段。扩增碱基出错率为10-5左右。Pfu:目前保真度最高的耐热DNA聚合酶,碱基出错率为10-6,但扩增效率低于Taq酶,一般能很好的扩增2kb以下的片段。Taq Plus:集扩增效率高和保真度好于一身。扩增效率比Pfu高,保真度比Taq好。能有效的扩增10kb以下的片段。Hotstart Taq:经过化学修饰的耐热DNA聚合酶。此酶在常温下,活性被化学基团封闭,要在94℃-95℃加热数分钟才能回复正常活力开始反应,避免了起始循环较低温度下的非特异性扩增,提高了反应的灵敏度和特异性。Long Taq:具有3’-5’外切酶活性的耐热DNA聚合酶,它不但扩增效率高而且错配率低,对于简单模板可扩增长达40kb的模板,对复杂模板也可扩增长达15kb的片段。Taq Platinum:热启动

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【分享】实验室最危险的17种物质(转)

大家都是搞pcr的,觉得这个帖子不错所以就转载了! 实验室最危险的17种物质。。。 慢性毒性,最易忽视~ 各位兄弟姐妹们务必小心 1.DMSO: DMSO是二甲基亚砜, 用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性,有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。 DMSO也是一种渗透性保护剂,能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成,减轻自由基对细胞损害,改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。 但是研究表明,DMSO存在严重的毒性作用,与蛋白质疏水集团发生作用,导致蛋白质变性,具有血管毒性和肝肾毒性。 DMSO是毒性比较强的东西,用的时候要避免其挥发,要准备1%-5%的氨水备用,皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤. 最为常见的为恶心、呕吐、皮疹及在皮肤、和呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。 吸入:高挥发浓度可能导致头痛,晕眩和镇静。 皮肤:能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感,如同所见的皮疹及水泡一样。若二甲基亚砜与含水的皮肤接触会产生热反应。要

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【信息】全新高效多能免乳化多肽佐剂---赛弗诺(SAFENOUR)

Safenour多肽佐剂:新型、高效、多能的多肽免疫佐剂 ★ 广谱性:SAFENOUR本身无免疫原性,作为注射/口服佐剂,可用于绝大多数重组蛋白/多肽疫苗、减毒/灭活疫苗,应用范围广泛。 ★ 高效性:SAFENOUR仅需5μg每只小鼠的剂量就能引发很强的免疫反应,注射免疫效果超过氢氧化铝佐剂、白油佐剂,皮下注射和弗氏佐剂效果相当,而腹腔注射免疫效果优于弗氏佐剂;口服免疫每只小鼠需要100-200μg,免疫效果和霍乱弧菌毒素B亚单位相当。 ★ 多能性:SAFENOUR既可注射免疫,又能口服免疫;既能诱导体液免疫,又能诱导细胞免疫;既能用于完全抗原,也能用于多肽表位等半抗原。 ★ 安全性:SAFENOUR本身是小分子量的多肽类物质,口服后本身不被肠道吸收,口服免疫每只小鼠SAFENOUR用量为30mg以下无明显毒副反应;注射免疫每只小鼠在200μg以下无明显毒副作用,注射部位无结节、红肿、发炎、脱毛等副反应。 ★ 快速性:使用SAFENOUR佐剂第一次免疫后一周即可进行第二次免疫,两次免疫后就能检测到较高滴度的抗体,三次免疫用时仅2周,能在体内诱导产生高滴度抗体。 ★ 易用性:SAFEN

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【共享】Cancer cell:VEGF能抑制肿瘤细胞浸润和间质转型

血管生成(Angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管,肿瘤血管生成的发生一方面是由于肿瘤细胞释放血管生成因子激活血管内皮细胞,促进内皮细胞的增殖和迁移,另外一方面也是因为内皮细胞旁分泌某些血管生长因子刺激肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞和内皮细胞的相互作用自始至终贯穿于肿瘤血管生成的全过程。 通常,肿瘤新生毛细血管是在原有的血管基础上延伸扩展而形成的,其过程类似于典型的伤口愈合和胚胎形成过程。这些新生血管为不断浸润生长的原发肿瘤提供营养,反过来,肿瘤细胞在生长过程中又分泌多种物质以加速肿瘤新生毛细血管的形成。 越来越多的研究表明,良性肿瘤血管生成稀少,血管生长缓慢;而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此,血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。 但最新研究再次证实用贝伐单抗抑制血管内皮生长因子信号结果导致胶质母细胞瘤(GBM)小鼠模型以及GBM患者体内的肿瘤细胞更具侵袭性。相关研究论文发表在国际权威杂志Cancer cell上。研究数据表明血管内皮生长因子(VEGF)直接负调控肿瘤细胞的侵

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【共享】美国著名华裔科学家陈昭妃博士,揭秘免疫系统惊人真相!

本文作者为陈昭妃博士,著名美国华裔科学家,“营养免疫学”的创始人。1997年,她荣获“美国十大杰出青年奖”,是59年来首位获此殊荣的华人,也是获此奖项唯一的女性。 寻找疾病的真正病因 1928年,抗生素诞生了,我们向世人宣称能够控制所有感染性的疾病。但我们没有想到,抗生素会给人类带来一系列疾病。过去,医学人员认为是病毒、细菌制造了疾病。但是现代研究发现,有10%的病人感染依波拉病毒,但并没有死于这种病,原因在于他们身体里有抵抗力;同样,有30%的肺结核病人并没有出现严重的症状,而且还可以自行恢复。科学家认识到,是否患肺结核取决于自身免疫系统;艾滋病,有5%的人感染后5年甚至10年也不发病。在各种宣传资料上,都提到HIV病毒,但我没有在任何的医学报告上看到实验证明是HIV病毒制造的艾滋病。我们所看到的实验报告上是这样写的:所有的艾滋病人体内都有HIV病毒的存在。这两种意思是完全不同的。 我举个通俗的例子:这里有一堆垃圾,有垃圾的地方自然会有苍蝇,但这并不表示说,是苍蝇制造了垃圾。而以前我们认为苍蝇就是病因,然后赶快发明一种化学武器出来,将苍蝇消灭掉;杀死苍蝇以后,垃圾里又跑出蚊子,我们又

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APAAP法检测淋巴细胞表面的IL-2

分泌IL-2的淋巴细胞检测试剂(APAAP法) T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群,在正常机体内各T淋巴细胞亚群相互作用,维持着机体正常的免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时,就可导致机体免疫紊乱并发生一系列的病理变化。目前越来越多的研究证明,T淋巴细胞在各种临床疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病,再生障碍性贫血、病毒感染、恶性肿瘤等都有异常改变,在各种疾病的发生,发展过程中不同的T淋巴细胞又产生着极其重要的影响。在自身免疫性疾病(如活动性系统性红斑狼疮)中,T抑制/细胞毒细胞(CD8+)的数量和功能低下是发病的重要因素,有时也有T辅助/诱导细胞(CD4+)数量和功能的增高;在乙型肝炎、自身溶血性贫血、类分湿症,重症肌无力等患者都具有类似的T亚群异常的特征。CD4+/CD8+比值减少是免疫缺陷病的重要指征,在AIDS病人中就存在着CD4+细胞显著减少的现象;在一些上呼吸道感染的病人中CD8+细胞的数量和功能都有异常增高的现象。很多感染性疾病(如水痘、猩红热、麻疹病人)都和免疫抑制有关,CD4+/CD8+比值的倒置被认为是病毒感染性疾病的重

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Eli-spot 方法

1 预期用途 Eli-spot分析是设计用于在单细胞悬液中计数分泌细胞因子的细胞数量的方法。这个方法的优点在于只需在体外进行很少的处理从而使细胞因子产生的分析尽可能接近于体内状况。这个技术用于测定在给予一定刺激的情况下细胞因子产生细胞的数目,以及在某种处理或病理条件下的细胞因子产生细胞的数量。 2 主要原理 细胞刺激后,原位产生的细胞因子被一种特异的单抗捕获,在细胞溶解后,捕获的细胞因子与第二种生物素化的检测性抗体结合,后者进一步通过与连接碱性磷酸酶的链亲和素结合被识别。PVDF包被孔的板之后与BCIP/NBT底物作用,紫色的斑点提示单个细胞产生的细胞因子。 3 5×96孔试剂盒的内容物 ▲ 捕获抗体(0.52ml),置于4℃。 ▲ 生物素化检测抗体(冻干,重悬于0.55ml水中)。 ▲ 抗生物素蛋白链霉素-碱性磷酸酶结合物,置于4℃。 ▲ 牛血清白蛋白(1g),置于4℃。 ▲ 撇去的干牛奶(1g),放于室温。 ▲ 备用底物溶液(50ml),置于4℃。 ▲ 96孔PVDF包被板。 ▲ 96孔PVDF-包被板 ▲ 细胞培养基 ▲ CO2孵箱 ▲ 70%乙醇 ▲

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【分享】引物延伸分析(primer extension analysis)

在研究启动子区时往往采用引物延伸分析(primer extension analysis,看了些相关资料,感觉收获不小,和大家分享一下。 1、引物延伸分析(primer extension analysis) 引物延伸分析用于定量mRNA的量,测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端, 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域,随后用RNA作为模板,用反转录酶延伸引物得到cDNA,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数,所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 长度为20-40个核苷酸,与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸,可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏,可检测2 pg的转录产物,这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。 (1)引物延伸分析所用试剂:引物延伸实验需要模板RNA,可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物,用反

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【分享】如何查找一个基因的启动子序列

定义:启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录,调控区域能够对不同的环境条件作出应答,对基因的表达水平做出相应的调节。 区域:启动子的范围非常大,可以包含转录起始位点上游2000bp,有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点,因此也属于启动子范围。 这项搜寻要从UCSC基因组浏览器开始,网址为http://genome.ucsc.edu/。以编码pendrin (PDS)的基因为例来说明上述问题。PDS与耳蜗的异常发育、感觉神经性听力下降以及弥散性甲状腺增大(甲状腺肿)有关。 进入UCSC的主页后,在Organism的下拉菜单中选择Human,然后点击Browser。使用者现在到了人类基因组浏览器入口。本例的搜寻很简单:在assembly的下拉菜单中选择Dec. 2001,在position框中键入pendrin,然后点击Submit。返回的页面结果显示一个已知的基因和两个mRNA序列。继续点击mRNA序列的登录号AF030880,出现包含这个mRNA区域的图解概要。为了获得这个区域更清晰的图像,点击紧

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