（一）酶标抗体的条件 1．纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。 2．特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。 3．效价高 一般琼脂扩散鉴定为1�64以上才算合格。 （二）酶标记方法 1．交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。 戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 ⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将1

免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。1.1　抗原　　抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten）。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。一个抗原分子可带有不同的决定簇。1.2　抗体1.2.1　抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（

1. 目的：采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。 2. 该SOP变动程序 本标准操作规范的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 3. 基本概念 【质量控制】 是监视ELISA操作全过程，排除误差，维持标准化操作的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的： 1. 确定控制的对象； 2. 规定控制对象的标准（预期值）； 3. 制定或选择控制方法和手段； 4. 测量实际数据； 5. 比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。 6. 采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。 质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的"控制限"进行比较的图

1. 目的：保证ELISA检测结果准确可靠, 充分发挥其方法学的优点。 2. 该SOP变动程序：本标准操作规范的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 3. 方法 3.1 分析前质控 3.1.1 人员培训 ⑴ 实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识： 4 检验项目的基本原理（ELISA原理）； 5 临床意义； 6 熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点； 7 熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）； 8 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。 9 某些特殊项目检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。 3.1.2. 室内质控血清的制备： ⑴ 质控血清每年列出计划报质控组采购，一般采

免疫细胞如何快速而有效地捕获流感疫苗、促成保护性的抗体反应？在3月在线出版的《自然—免疫学》期刊上，研究人员解释了这种机制。 抗原是一种被引进人体内后可以促进抗体产生的物质。抗原呈递枝形细胞是一种能捕获和处理抗原的免疫细胞，并能让这些抗原激活其他免疫细胞如B细胞等。实验中，疫苗使用的抗原是一种沉寂态的流感病毒。 MichaelCarroll和ShannonTurley发现，引流淋巴结中的抗原呈递枝形细胞抓住了病毒表面上的糖。这种糖被一种名为SIGN-R1的受体所识别。阻断SIGN-R1能抑制对流感病毒的抗原呈递枝形细胞的识别，更重要的是让随后发生的B细胞抗体反应也变得迟钝，而这种反应是抗体产生的条件。 科学家们还能够在对流感病毒产生免疫反应的小鼠的淋巴结上看到活抗原呈递枝形细胞的活动。在免疫接种之前，淋巴结上的抗原呈递枝形细胞是静止的，但利用其SIGN-R1受体捕获到淋巴结上不活跃的病毒后，这种细胞开始运动了，并移向B细胞母体丰富的地方。 抗原呈递枝形细胞捕获病毒并释放出B细胞的能力确保抗体反应的发生，可抗击流感病毒等复制速度快的病原菌。

移植排斥反应是反映由移植抗原诱导的免疫应答所致的移植物功能丧失或受者的机体损害的一种免疫损伤。主要原因是供受体间组织相容性抗原的差异。排斥反应有两种基本类型：宿主抗移植物反应（HVGR）和移植物抗宿主反应（GVHR），临床上多见是前者；根据发生的机制、时间、速度和临床表现，HVGR又可分为3种类型：超急排斥反应；急性排斥反应；慢性排斥反应。 　　一、超急性排斥反应 　　超急排斥反应发生在移植物与受者血管接通的数分钟到数小时内，出现坏死性血管炎表现，移植物功能丧失，患者有全身症状。发生的基本原因是受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统，导致血管内凝血。常见于下列情况：①ABO血型不符；②由于多次妊娠或反复输血等使受者体内存在抗HLA抗体；③移植物保存或处理不当等其他原因。超急排斥发生迅速，反应强烈，不可逆转；需立即切除移植物，否则会导致受者死亡。如果事先认真进行ABO基至Rh血型检查和交叉配合试验，多可避免这种现象的发生。 　　二、急性排斥反应 　　急性排斥反应是排斥反应最常见的

【目的】 保证免疫金标技术检验准确性 【本SOP 适用范围】 免疫金标技术 【该SOP 变动程序】 本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【原理】 氯化金分子在还原剂作用下聚合形成金颗粒，颗粒与颗粒之间因静电作用而相互排斥，使其保持一个比较稳定的胶体状态，故称作胶体金。利用胶体金颗粒的高电子密度及其表面能结合生物大分子(如抗体、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A 等)以 及具有一定颜色等特性，可用光镜和电镜对细胞内抗原进行定位、定性的研究。 【方法学分类】 1. 班点金免疫渗滤试验 固相膜免疫测定中液体在微孔膜中穿过流出呈穿流形式，为斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有称免疫金溶胶斑点法、滴金免疫测定法等。试验单位为三层反应盒，第一层为过滤器(滤纸层)，第二层为反应膜(NC 膜或MC 膜)上点加有特异性抗原或抗体，第三层为吸水垫料，有称此渗滤装置为滴金反应板。 以双抗体夹心法测dsDNA 为例：试

慢性排斥反应属于迟发型变态反应，发生于移植后数月甚至数年之后，表现为进行性移植器官的功能减退直至丧失；病理特点是血管壁细胞浸润、间质纤维化和瘢痕形成，有时伴有血管硬化性改变。其机制可能为急性排斥细胞坏死的延续；炎性细胞相关的慢性炎症；抗体和细胞介导的内皮损伤；管壁增厚和间质纤维化。本型反应虽然进展缓慢，但用免疫抑制治疗无明显的临床效果。 　　以上属宿主抗移植物反应（HVGR）。移植物抗宿主反应（GVHR）多发生于同种骨髓移植者，也可见于脾、胸腺和小肠移植中；此时患者的免疫状态极度低下，而移植物中丰富的免疫活性细胞则将受者细胞视为非己抗原，对其发生免疫应答；移植物的T细胞在受者淋巴组织中增殖并产生一系列损伤性效应。GVHR分为急性与慢性两型。急性型多见，多发生于移植后3个月以内，患者出现肝脾肿大、高热、皮疹和腹泻等症状；虽是可逆性变化，但死亡率较高；慢性型由急性型转来，患者呈现严重的免疫失调，表现为全身消瘦，多个器官损害，以皮肤和黏膜变化最突出，病人往往因严重感染或恶病质而死亡。 　　移

化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型： 　　（一）化学发光酶免疫测定 　　化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒。 　　（二）化学发光免疫测定 　　化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。 　　用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件： 　　1.能参与化学发光反应。 　　2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。 　　3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。 　　4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。 　　鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记

随着免疫学理论研究的深入，发现的细胞因子日益增多，并在免疫应答的调节和效应中起着重要作用，其在体内水平的高低直接反映机体的免疫状况。细胞因子检测的方法主要分三类：①细胞生物学活性检测法。②免疫学标记技术，常用ELISA。③分子生物学方法，常用逆转录PCR检测细胞因子的mRNA转录的情况。现以生物活性法为例选择性地介绍几种细胞因子的检测。� 一、人类干扰素的检测� 人类干扰素(humaninterferon，HuIFN)有α、β和γ三种，其中HuIFN-γ由T细胞产生，三种HuIFN都有抗病毒作用，因此可利用病毒的各种生物学特性建立相应的检测方法，如血凝素生成抑制试验，是以人肺癌细胞株A549作为小鼠脑脊髓心肌炎病毒的敏感细胞，将此病毒接种于A549的单层细胞培养中，可产生使人“O”型红细胞凝集的血凝素。若在此培养中加入可能含有IFN的血清标本，由于IFN能抑制病毒在细胞中的生长，而使血凝素产生降低，借助“O”型红细胞的凝集反应判断IFN的活性。本方法既可定性又可定量。� 二、白细胞介素-1(IL-1)的检测� 取肝素抗

近年来，肺癌的肿瘤标志物（tumor marker，TM）研究十分活跃。肺癌常用的肿瘤标志物很多，根据美国NACB准则，这里主要介绍神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胃泌素释放肽前体 （ProGRP）、癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）和鳞状细胞癌相关抗原（SCCA）等几种比较肯定的肿瘤标志物。 表1 国际上不同专家组对肺癌标志物应用的建议 1．神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enol ase，NSE） 是烯醇化酶的一种同功酶，目前认为它是小细胞肺癌（SCLC）和神经母细胞瘤的肿瘤标志物。烯醇化酶同功酶根据α，β，γ三个亚基的不同，可分为 αα，ββ，γγ，αβ和αγ五种二聚体同功酶。α亚基主要存在于肝，肾等组织；β亚基主要存在于骨骼肌和心肌；γ亚基主要存在于神经组织。γγ亚基组成 的同功酶属神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶，此酶在正常人脑组织中含量最高，起源于神经内分泌细胞的肿瘤组织也有异常表达，研 究发现SCLC也是一种能分泌NSE的神经内分泌性质肿瘤。NSE分子

目前已有许多新生物学技术应用于免疫学研究，促进了免疫学的发展，丰富了免疫学检测的内容，使免疫学研究与相关疾病的诊断建立在基因水平，提高了检测的敏感性和可靠性。 � 一、分子杂交技术� 分子杂交的基本原理是根据双链DNA经高温解链成两条互补的单链，降温后又可恢复原来的双链。两条不同的单链分子可根据碱基配对的原则，只要它们的碱基序列同源或部分同源，即可全部或部分复性，此称核酸杂交。用来探测DNA的已知互补片段称为DNA探针，通常是应用已预先经放射性标记或非放射性标记的DNA单链来识别另一核酸分子中与其同源的部分，其特异性和敏感性极高。实验方法有印迹杂交(southern blot)、斑点杂交和原位杂交。目前分子杂交技术已应用于免疫球蛋白分子、T细胞受体、补体、细胞因子以及MHC分子的基因结构、功能及表达等方面的研究。� 二、转基因技术� 转基因技术是近年来生物技术中的一项重大突破。其建立使得动物可不必通过有性杂交即能获得新的基因。其基本原理是通过显微注射或逆转录病毒，将外源性基因导入哺乳动物的受精卵或其早期胚胎，并经分子杂交分析胚胎或其后代组织

抗原(antigen,Ag)──是一类能刺激机体的免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质。 1、抗原具有两种特性： （1）免疫原性(immunogenicity)：抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质（抗体和致敏淋巴细胞）的特性。 （2）免疫反应性(immunoreactivity)：抗原与相应的免疫效应物质（抗体和致敏淋巴细胞）在体内或体外相遇时，可发生特异性结合而产生免疫反应的特性。 完全抗原──具有免疫原性和免疫反应性的物质。 不完全抗原/半抗原(hapten)──仅有免疫反应性，而缺乏免疫原性的物质。 抗原的命名和性能 免疫应答刺激物 广义命名 引起

可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。 沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。 1、环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。 2)、絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。 3、琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单

抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应(serological reaction)。� 一、抗原抗体反应的特点� (一)抗原抗体结合的特异性� 抗原借助表面的抗原决定簇与抗体分子超变区在空间构型上的互补，发生特异性结合。同一抗原分子可具有多种不同的抗原决定簇，若两种不同的抗原分子具有一个或多个相同的抗原决定簇，则与抗体反应时可出现交叉反应(cross reaction)。 (二)抗原抗体结合的可逆性� 抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。�

免疫诊断是临床辅助诊断的重要组成部分，为临床疾病的诊断提供重要的参考信息，随着上世纪60年代人们弄清抗体的分子结构和功能后，免疫学诊断技术得到了突飞猛进的发展。 　　在历史上较为经典的免疫诊断是酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），该方法最先由Engvall和Perlmann两人在1971年发表，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。 　　此方法仍然是目前临床用得最多的检测方法，但酶联免疫吸附试验方法需要在加入受检标本和酶标抗体时有半小时至一小时的孵育时间，中间还须经过数次洗板过程才能加入反应底物进行显色后在酶标仪上完成检测，步骤较为繁琐费时。人们希望能有一种快速、简便的诊断方法来对受检标本进行检测，于是纳米金免疫标记技术和蛋白芯片技术的出现为这一想法提供了突破口。 　　胶体金溶液是指分散相粒子直径在1～150 nm之间的金溶胶，其中中等大小的胶体金（10～20nm）呈酒红色。1974年，Romano等人将胶体金标记在第二抗体（马

用体外或体内试验对机体的各种参与免疫应答的细胞进行鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断，预后及疗效观察等也具有一定意义。� 一、免疫细胞的分离� 体外测定免疫细胞首先要从外周血或淋巴组织中分离所需的细胞。其主要方法是根据细胞的表面标记、理化性状及功能等方面的差别进行设计。常用的方法有密度梯度离心法辅以花环沉降或亲合板粘附法(panning)等。目前最先进的方法是用荧光激活细胞分离仪(fluorescenceactivited cell sortor，FACS)可自动、快速和大量地分出各类纯度高、活性强的细胞。� (一)外周血单个核细胞的分离 图18.7 淋巴细胞分离(Fieoll密度梯度法) 主要方法为聚蔗糖泛影葡胺分层液(ficoll hypaque)密度梯度离心法。分离人外周血单个核细胞时，通常将分层液的比重配成1.077，肝素抗凝血置分层液上，于水平离心机2000r/min离心20分钟，血液中各种细胞因比重不同而被分开(见图18.7)。此外，分层剂还可选用Percoll、Me

从上世纪30年代来，癌症的死亡率没有得到很大的改观。科学家们希望能通过从复杂的生物样本中分离鉴定出敏感特异的肿瘤特有的标记，来帮助肿瘤诊断，评估预后，评估肿瘤的分期，复发，药物靶位点等。这就是肿瘤标记物，肿瘤标记物首先是通过利用从肿瘤细胞中提取的单克隆抗体发现的。在获得抗血清后，通过免疫吸附去掉正常细胞，留下肿瘤特异性的抗原，筛选并评估这些候选物成为了寻找新的肿瘤标记物的经典方法。但是这种方面费时又耗力，因此寻找一个快速的评估大量潜在的肿瘤标记物方法十分必要。 人类发现的肿瘤标志物已有百余种，但临床常用的仅20多种，能用于大规模人群普查的肿瘤标志物更少。临床上肿瘤的高发生率和死亡率迫切需要新的早期诊断用的生物标志物和新的肿瘤标记物检测技术。 检测肿瘤生物标记物的纳米探针技术 来自浙江加州国际纳米技术研究院，纳奥生物公司的研究人员结合分子生物学和纳米技术，发现了一种能特异快速检测多种肿瘤血清生物标记物的纳米探针技术，能够大大提高肿瘤标记物检测灵敏度和有助于发现新的标记物。 这一技术结合了RNA干扰技术和纳米纤维技术，在国际上首先实现了小干扰RN

补体系统的各组分在体液中通常以非活性状态、类似酶原的形式存在，当受到一定因素激活，才表现出生物活性。补体的激活途径主要有两种，即经典途径和替代途径，此外尚有MBL（甘露糖结合凝集素）途径。 　　经典途径和替代途径两种途径的启动过程不一致，但经典途径的激活可以导致替代途径的活化，反之则不行。 　　补体的其他激活途径即甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径，简称MBL途径。此途径开始于急性期蛋白与病原体的结合，而不是抗原复合物形成。 　　1.经典途径：经典途径是以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体C1～C9共11种成分全部参与的激活途径。除了抗原抗体复合物外，还有许多因子可激活此途径，如非特异性凝集的Ig、细菌脂多糖、一些RNA肿瘤病毒、双链DNA、胰蛋白酶、纤溶酶、尿酸盐结晶、C-反应蛋白等。经典活化途径可人为地分成识别、活化和膜攻击3个阶段。 　　2.替代途径：替代途径又称旁路途径。它与经典途径的不同之处主要是越过C1、C4和C2，直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程；参与此途径的血清成分尚有

1.[临床血液学检验]酸性磷酸酶染色阳性的是（）。 A．CLL的淋巴细胞 B．淋巴肉瘤细胞 C．多毛细胞白血病细胞 D．尼曼－匹克细胞 E．B淋巴细胞 【解析】酸性磷酸酶染色中可见：①粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞呈阳性。②戈谢细胞为阳性反应，尼曼－匹克细胞为阴性反应。③多毛细胞白血病时多毛细胞为阳性反应，淋巴肉瘤细胞和慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞，也呈阳性反应。④T淋巴细胞呈阳性反应，而B淋巴细胞为阴性反应。ABC =================================== 2.[临床检验基础]婴儿消化不良时呈乳凝块便，其主要成分为（）。 A．脂肪 B．变性脂肪 C．酪蛋白 D．脂肪及酪蛋白 E．蛋白质 【解析】婴儿粪便中可见白色、黄色或绿色的乳凝块，提示脂肪或酪蛋白消化不完全。D =================================== 3.[临床血液学检验]某病人拟诊断PNH，下列哪项检查与此病诊断无关（）。 A．Ham试验 B．Rous试验 C．糖水试验 D．