不同样本破碎和匀浆中常见问题及解决方案
凯杰
植物样本
植物组织中常富含酚类、多糖或者其他次级代谢产物，细胞破碎后这些物质就会与 RNA 发生作用，导致 RNA 活性丧失或降解。纯化的产物中含有代谢物，影响 RNA 的质量且在下游实验中抑制酶的反应。另外，粘度增加导致移液误差。
解决方案
1. 使用在不诱导高水平代谢物的条件下生长的植物（采样前让植物在黑暗中生长 1 - 2 天），尽可能使用新鲜、幼嫩、健康的组织。
2. 如果粘度较大，可适当将枪头的前端剪去 2-3 mm，提高移液效率。
动物组织如心脏、肌肉以及皮肤组织
组织中含有丰富的收缩蛋白和结缔组织，以及干扰 RNA 分离的胶原蛋白。
解决方案
1. 对于含有丰富的收缩蛋白和结缔组织，组织细胞密度低，其中 RNA 含量较少，可以适当增加材料的起始用量。
2. 务必要在低温冷冻条件下将组织彻底磨碎，并尽量尽快研磨成粉末状。
3. 用蛋白酶或含有苯酚的试剂处理样本。
内源性 RNase 含量高的组织如肾脏、肠、脾脏、胸腺以及胰腺
该类样本中 RNase 含量很高，提取过程中很容易发生 RNA 的降解。
解决方案
1. 尽量使用新鲜组织，采样不宜太大，尽可能缩短样本采集和快速冷冻的时间。
2. 即时加入 RNA 稳定剂，使组织内的 RNase 失活及保护组织中的 RNA。
3. 快速匀浆，加入裂解液若粘稠至不能有效分层，可继续加入更多裂解液。
4. 采用 RNeasy Mini Kit（货号：74104）提取时，可将缓冲液 RLT 中加入的巯基乙醇含量提高至 3%-5%，能够有效改善结果。
血液样本
提取得到的 RNA 量少；由于 RNase 得到的 RNA 完整性较差，有降解；污染物包括抗凝剂-肝素和 EDTA，以及天然酶抑制剂影响下游 RNA 分析实验。
解决方案
1. 血液越新鲜越好，在血液收集管中使用 RNA 稳定试剂来保存 RNA。
2. 血液 RNA 提取本质上是白细胞 RNA 提取，使用 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法回收单核细胞。
3. 去除抗凝剂和酶抑制剂。
4. 可采用专门用于血液样本的 RNA 提取试剂盒（如：QIAamp RNA Blood Mini Kit，货号：52304），其中含有高效的红细胞裂解液，在有效裂解细胞的同时也能防止其中释放出的大量 RNase 对后续 RNA 提取的影响。
FFPE 样本
FFPE 样本中的核酸在进⼊福尔马林浸泡之前就开始发⽣降解；样品基质内核酸易发⽣⽚段化、核苷酸碱基修饰以及核酸与蛋⽩的交联。
解决方案
1. 使用厚度不超过 5 mm 的组织样本，组织固定前的操作时间应当越短越好，避免 RNA 降解。
2. 不要过度固定（最多 24 h），固定时间越长，交联程度越⼤，样本中的 RNA 降解越厉害。
3. 推荐使⽤中性的福尔马林缓冲溶液及优质试剂进行石蜡包埋，不含添加剂。
4. 尽可能避免样品染色。
5. 可考虑使用专门的环保型脱蜡液，降低对实验环境的要求，简化加速实验流程，同时结合高效的交联逆转步骤，提高核酸的回收效率与质量。
病毒样本
低滴度和高度的二级结构导致产量低和下游分析困难；复制时容易发生突变。
解决方案
1. 尽可能使用新鲜的样本，或冻融次数不超过一次，多次反复冻融会导致病毒载量下降。
2. 在分离 RNA 之前，通过超速离心、超滤或沉淀浓缩病毒颗粒。
3. 在 RNA 纯化时添加载体 RNA，如 QIAGEN Carrier RNA（货号：1068337）。
细菌样本
高度不稳定，mRNA 很容易快速降解。
解决方案
1. 样本采集时，加入 RNA 稳定剂，立即使 RNase 失活和稳定及保护组织中的 RNA。
2. 可考虑采用更为快速的研磨方案，降低研磨过程中产生的大量热量对 RNA 降解的加速，如 PowerLyzer 24 结合特定的珠磨研磨技术。
