间接IM―PCR (以神经肽Y的检测为例)
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间接IM―PCR (以神经肽Y的检测为例)
【试剂与配制】
（1）TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL
（2）封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制）
（3）抗神经肽Y单抗
（4）兔抗神经肽Y抗体
（5）生物素化羊抗兔IgG
（6）亲合素
（7）DNA指示分子(生物素―AdAT)
（8）PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP-DNA聚合酶0.5μl,蒸馏水31.5μl
【操作方法】
(1) 用TBS稀释抗神经肽Y的McAb（1:200），取稀释抗体50μI加入微量离心管中，4℃过夜，弃去液体,用TBS洗涤一次；
(2) 加200μl封闭液，37℃放置2h，弃去液体,洗涤2次；
(3) 将神经肽Y用TBS稀释为5.0μg/ml～5.0×10-13
g/ml，各取50μl加至0.5ml离心管中,置于37℃水浴30min，弃液体,洗涤3次,每次5min；
(4) 加5.0μl稀释的兔抗神经肽Y抗体（1:400），37℃温育30min， 同上洗涤；
(5) 加50μl生物素化羊抗兔IgG抗体(1:500), 50μl亲合素（10ng/ml）,37℃温育30min,同上洗涤；
(6) 加50μl DNA指示分子（10ng/ml），37℃温育30min，弃去液体，同上洗涤5次，去尽液体。
(7) 加50μl PCR反应液，液体石腊25μl；
(8) PCR扩增:94℃×60s,55℃×60s,71℃×120s；30个循环；
(9) 取5μl PCR扩增产物加入2％琼脂糖凝胶上,电泳1h(2v/cm)。用EB染色,紫外灯下拍照,激光扫描定量。
