原代细胞骨架的染色方法
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微丝的显示方法步骤:
1. 用PBS液漂洗盖片培养的原代细胞3次,每次30s;
2. 用2%的甲醛/PBS液固定原代细胞3min;
3. 用0.5%的三硝基甲苯/PBS处理3次,每次10min;
4. PBS漂洗3次;
5. 用罗丹明(rhodamine)标记的鬼笔环肽(phalloidin)(1:10)室温中反应15min;
6. PBS漂洗3次;
7. 60%甘油+荧光防淬剂封片;
8. 荧光显微镜观察;
微管的显示方法:
1. 用PBS液漂洗盖玻片的原代细胞3次,每次30s;
2. 在室温中用3%甲醛/PBS固定20min;
3. 用PBS液再漂洗3次,每次1min,最后用滤纸吸干多余的PBS液;
4. 投入冷丙酮中(-10—-20℃)7min;
5. 用PBS漂洗3次,每次1min,最后用滤纸吸干多余的PBS液;
6. 向直径6cm的干净碟皿中央滴一滴浓度为0.1—0.2mg/ml的一级抗微管蛋白抗体,令小盖片细胞面向下扣在抗体液上,覆以皿盖,于37℃温箱中放置45min—1h;
7. 向碟皿内匀速缓慢滴加PBS,令盖片浮起在液面,用镊子夹出,按步骤3处理;
8. 向干净碟皿中央滴一滴浓度为0.1—0.2mg/ml的荧光标记的二抗,其后操作按步骤6进行;
9. 按步骤7和3操作;
10. 滴pH8.5的90%的甘油/PBS少许于载玻片上,把小盖片的原代细胞面覆在大盖片上;
11. 将盖片置于荧光显微镜下观察;