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加速显微观察实验的 5 个实用方法

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1. 观察更多样品

倒置显微镜载物台采用诸如 160×110 mm 尺寸 K 接口的通用底座标准,可以选择用于处理各种样品的载物台插件。

这样可以观察多个培养皿或多个载玻片,可以同时进行实验,节省大量时间。这种方法减少了用于更换标本和设置常规实验的时间。

图1.通过用在显微镜载物台上放三个培养皿取代放置一个培养皿,可以缩短用于实验准备和设置优化的时间,继而缩短了在实验室停留的时间

 

2. 加快速度

接下来就是优化图像采集速度。通常拖慢图像采集速度的瓶颈是滤色片或荧光镜组的机械切换过程,可以尝试以下方法:

  • 优化图像采集顺序:如果采集 Z 序列图像时的Z轴移动速度快于荧光滤色片的更换速度,则应现在一个荧光通道采集Z序列图像后,再转到下一荧光通道的方式进行(图 2,中间)。

 

  • 结合使用多通滤色镜组和 LED 光源:一些显微镜技术无需权衡取舍就能够实现某些改进。LED 光源和多通滤色片组合就是其中之一。尽管每个通道的单通专用滤色片通常是防止荧光串色的理想解决方案,但最新 LED 光源足够锐利的光谱可以避免串色并具备快速波长切换功能。这可以利用多通滤色片的优势缩短图像采集时间。使用多通滤色片的一个技巧是,尽可能使用波长更长并且更亮的染料。原因是从较短波长(能量较高)到较长波长(能量较低)会发生串色。

图 2.显示每个序列需要多长时间的图像采集序列变化。(上)Ch> Z 序列,(中)Z> 通道序列,可以通过减少切换通道的机械运动节省时间;(下)Ch> Z 序列,通道切换不存在机械运动。

  • 减少 Z 序列的数量:另一个考虑因素是减少 Z 采集的时间。如果拥有足够可靠的自动对焦设备,就无需采集太多的 Z 位置,并且可以缩短图像采集时间,从而将激发光的光毒性降至最低。

 

3. 在工作效率和图像质量之间取得平衡

图像质量决定了下游分析的质量,如何采集最佳质量的图像,有两个方面需要思考:

  • 速度与质量:图像质量的主要取舍因素是视场(FOV)和图像采集时间。

当不使用视场外围区域时,就可以获得更平坦、更均匀的图像。然而,这会导致在相同区域采集更多数量的图像,因此需要更长的采集时间。但可以实现无缝拼接或精确定量分析,并且受外围区域的图像不均匀性影响最小。但是,如果不需要完美的无缝拼接图像,并且能够获得足够的分辨率,那么可以考虑使用更宽的视场或更低的倍率(图 3)。

图  3.(上)光轴和视场周边区域的光强度是影响图像质量的一项因素。当我们观察到较大视场时,阴影会更加严重。(左下)以较大视场进行拼接意味着需要的图像采集时间较短,但是图像接缝可能会很明显。在可以接受较低图像质量的情况下,这一策略可以加快实验速度。(右下)如果需要无缝拼接图像,则需要使用较小的视场。

 

  • 培养皿类型:尽管玻璃底的培养皿或多孔板对于图像质量而言最佳,但是聚苯乙烯多孔板不但可以节省成本还具有更好的细胞粘附性。以下为选择非玻璃底培养容器的技巧:
    • 培养容器类型会影响图像质量和工作距离(WD)。使用较厚的培养容器(如塑料多孔板)进行成像时,通常需要更长的工作距离。相比玻璃底培养容器 0.17 毫米的厚度,大多数塑料培养容器的厚度为 0.5 到 1 毫米。确保使用具备足够长工作距离的物镜配合较厚的培养容器。
    • 确认系统与塑料培养容器的兼容性。比如,由于塑料极性的原因,微分干涉差(DIC)不能使用塑料培养容器。
    • 塑料培养容器具有一定程度的自发荧光。较低的自发荧光程度不会造成过多的背景光,而较高的自发荧光程度可以掩盖标本的荧光。在选择实验使用的培养容器之前,务必要检查自发荧光的影响,尤其是在使用紫外线或蓝光激发的情况下。

 

4. 检查数据一致性和参考点

在对很多样品进行实验时,数据一致性和参考点是数据可靠性和可重复性的关键。为了实现这一目的:

  • 使用稳定的细胞系
  • 避免多孔板外围的环境一致性(尤其是温度)与中心区域存在差异
  • 始终设有阳性和阴性对照标本
  • 检查环境稳定性,尤其是室温

 

5. 利用隔夜机会

某些电动和自动化的系统(如高内涵筛选系统或全载玻片成像扫描仪)具有图像采集的批处理功能。批处理还可与分析软件一起使用。

 

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