如何选择合适的流式抗体

流式抗体的选择和配色原则由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。本文介绍如何选择合适的流式抗体：

1、需要满足抗体选择的最基本条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验等。

• 靶标特异性：确定标记物名称，确定是细胞表面表达，还是细胞内表达。细胞内表达需要进行透膜。
• 物种来源：确定待测样本的种属来源。例如，抗小鼠的抗体，不能用于人的样本的检测。
• 实验类型：大多数只标明用于WB、IP、IHC、IF、ChIP的抗体都不适用于流式实验(FC,flow cytometry)。选择标明用于FC实验的抗体，并有引用文献和实验数据图。
• 克隆号：有一些标记物有多个克隆号，选择文献报道中使用多，荧光标记种类多的克隆号。
• 厂家和批号：不同厂家或同一厂家生产的不同批号的相同荧光的相同标记物的抗体，荧光染料的强度可能有少许差别，不建议一次实验混合使用。

2、流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。

在流式实验过程中，直标抗体一抗上连接有荧光染料，间标抗体二抗上连接有荧光染料。直接标记染色背景低，实验程序少尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验。

3、流式抗体荧光标记的选择：

• 如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。以某仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。
• 如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道，流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如实验者同时检测三个指标，可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

4、同型对照的选择：

流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。

5、抗体的使用与保存

• 抗体稀释

适当的抗体使用浓度，才能真实地反应各种细胞的比例。抗体不足，可能出现假阴性结果；抗体过量，可能出现假阳性结果。可以通过检测抗体滴度，获得最佳使用稀释度。通常最佳使用稀释度会低于供应商建议的稀释度，不仅能获得可靠的染色结果，还可以将花费降到最小。

• 抗体保存

直标的流式抗体一般需要4℃避光保存，不要冻存。冷冻可能会导致荧光抗体沉淀和聚集，影响抗体的效价，随着先进技术的出现，冻干粉形式的抗体已经上市，如美天旎品牌的StainExpress™系列抗体可以在19−25°C环境下保存。

• 抗体选择

大多数只标明用于WB、IP、IHC、IF、ChIP的抗体都不适用于流式实验(FC,flowcytometry)。选择标明用于FC实验的抗体，在Panel设计上咨询专业人士，通过自己的实验结果进行改进，采用专业的工具进行配色辅助，文献和实验数据图作为参考。