FASEB J：动物肠菌合成宿主神经活性 D 型氨基酸

北京时间 7 月 12 日，中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组与伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 Jonathan V. Sweedler 教授团队合作，在 FASEB J 国际学术期刊上发表研究论文 Profiling of D-alanine production by the microbial isolates of rat gut microbiota。

文章建立了酶法定性快筛和手性色谱-质谱联用（chiral LC-MS/MS）准确定量的两级分析方法，对 38 株大鼠肠菌产 D 型氨基酸的能力进行了评估，在菌种和菌株水平观察到显著差异，为研究这类神经活性物质对宿主生理功能的调控提供了方法和基础。

Jonathan V. Sweedler 教授和司同研究员为本文共同通讯作者，Cindy J. Lee，Tian A. Qiu 和洪志来为共同第一作者，Huimin Zhao 教授和戴磊研究员作为共同作者对本文亦做出重要贡献。

我们的左右手互为镜像，彼此不能重合。自然界中，与其镜像具有不能互相重合构型或构象的分子被称为手性分子，这一组分子被称为对映异构体。有意思的是，生命有机分子绝大多数具有手性，且几乎都以单一异构体形式存在。

自然界中氨基酸有 L 和 D 两种对映异构体，除甘氨酸不具有手性外，组成蛋白质的其他氨基酸几乎都为 L 型。D 型氨基酸作为哺乳动物神经和内分泌系统中一类重要的神经和激素调节物质，具有重要的生理功能。不同于 L 型，D 型氨基酸的含量往往较低，其来源除了通过自身的合成外，主要通过食物的摄入和体内肠道菌的合成，特别是部分哺乳动物自身难以合成的重要 D 型氨基酸。同时，宏基因组研究也揭示人类肠菌 D 型氨基酸的生物合成和与 II 型糖尿病相关，微生物来源的 D 型氨基酸可能参与血糖稳态调节。肠道菌群是一个结构复杂和组成动态变化的「无形器官」，通过研究其 D 型氨基酸代谢物的谱图，有助于人们研究菌群和宿主健康的相互关系，阐明机制并开发针对肠道菌的疾病疗法。

本研究首先建立了一个大鼠肠道菌的分离和鉴定的高通量方案，然后采用酶法快速筛选大鼠肠道菌产 D 型氨基酸的能力，最后经 SCX-SPE 富集后采用手性 LC-MS/MS 对这些主要生产菌株进行 D 型氨基酸产物谱的准确定量（图 1）。

图 1：本研究的整体流程示意图

为了有效的分离肠道菌，作者首先选用了一种同时适合需氧菌和厌氧菌的 R 培养基，通过梯度稀释大鼠的肠道内容物后涂布在 R 平板上获得单菌落，并重复纯化直至获得纯菌。经过 MALDI-TOF 和 16S rRNA 鉴定后对获得的 600 余个纯培养菌株进行分类和归属，本研究共获得厚壁菌门中 4 个属的 11 种肠道菌，共 38 株。

随后，作者设计了高灵敏度、稳定性，适合大规模筛选的酶标法探索这些肠道菌产生 D 型氨基酸的能力：收集平板上的肠道菌，提取并富集其分泌 D 型氨基酸，以底物宽泛性广的商用 D 型氨基酸氧化酶（DAAO）与过氧化氢检测试剂盒联用，对产物中的 D 型氨基酸的总量进行评价。结果显示只有芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的肠道菌能够产生 D 型氨基酸，且在芽孢杆菌属内，菌株在种和菌株的水平上产 D 型氨基酸的能力也有差异，并与 16S rRNA 相似度没有明显的相关性（图 2），暗示单纯依靠 16S rRNA 测序获得微生物组菌种组成信息，无法准确预测菌群合成 D 型氨基酸的水平。

图 2：DAAO 法评估大鼠肠道菌生产 D 型氨基酸的能力与 16S rRNA 的关系

最后，鉴于 DAAO 对 D 型酸性氨基酸的活性较差，在确定了 D 型氨基酸的主要生产菌株后，作者通过对其中产量最高的 8 株菌做进一步 LC-MS/MS 分析，对包括 2 种酸性氨基酸和宿主无法合成的 D 型丙氨酸在内的 5 种 D 型氨基酸进行准确定量。作者先将产物通过 SCX-SPE 除盐并富集其中的氨基酸，并基于标准品计算这 5 种 D 型氨基酸回收率。根据标准品的保留时间和额外加样，作者确定了这些样品中 5 种目标 D 型氨基酸的含量（图 3）。值得注意的是，蜡样芽孢杆菌的 D 型氨基酸产物谱中存在高含量的两种 D 型酸性氨基酸，它们可能也存在于其他 DAAO 酶标法阴性的样品中。

图 3：利用 LC-MS/MS 对 D 型氨基酸的主要生产菌株进行产物谱分析

综上，本研究建立了基于酶反应和手性 LC-MS/MS 的 D 型氨基酸分析方法，对大鼠肠道微生物纯培养菌株开展快速定量表征，在菌种和菌株水平揭示了 D 型氨基酸产物谱与合成能力的显著差异，表明了纯培养和代谢分析在肠菌来源活性分子研究中的必要性，为研究 D 型氨基酸在哺乳动物中的代谢规律和生理功能提供了方法和基础。