糖分析

测试糖是否被包含在从活细胞内取出的蛋白质中, 过去一直使用苯酚-硫酸颜色分析法, 但是它的低敏感对现在的生物化学研究而言是不合适的. 现在正在使用的是免疫颜色法(면역착색법), 通过切割羟基邻接的糖得到高活性的醛, 或着使用维生素H-straptavidine(스트랩타비딘) 形成的配合物和磷酸酯酶的方法.

为分析糖蛋白类型中糖聚合物的结构必须被首先分离糖和蛋白质, 这需要化学方法和酶方法. 在化学方法中, 可以通过使用肼迅速分开O-或N-连接的糖并控制条件仅分离O-连接的的糖. 然而, 当肼被用于反应时, N- 乙酰基在反应中被切割掉于是需要额外的乙酰化步骤. 如果在一些胺的第一个位置没有胺上的乙酰基那就没有办法分离. 因为肽结构在肼反应条件下被分解, 还有蛋白质分析的问题.

在酶方法中, 用肽N-糖苷酶F(PNGase F)分离N-连接的糖是可能的而且有用的. 可是, 能与O-连接的糖广泛反应的酶还未被发现. 当糖被分离的时候, 为便于分析, 通常还原末端被萤光或放射性分子标记. 在元素分析之前, 首先用硅胶色谱测体积, 用阴离子交换树脂测离子数. 然后, 用HCl或TFA等酸做糖水解以得到单糖, 然后以GC或HPLC给出相对量. 这个过程与分析蛋白质时的氨基酸分析类似.

剩下的工作是决定糖的整个结构, 包括单糖的种类, 序列, 与羟基连接的位置, 异构体的三维结构, 侧链的结构, 单糖的光学结构, 以及化学分析如磷酸化作用, 硫酸化作用和甲酸化作用等. 还没有能够获得所有数据的简单过程, 于是就采用了NMR, 质谱, 酶分析等方法, 但是仍然耗费了大量时间和精力. 自动化RAAM(试剂排列分析方法)混合了几种酶, 能选择性分离一些试剂, 并通过与现有数据库比较得出糖结构. 然而, 由于可得到的酶的限制, 这种方法仅对已知基本结构的N-连接的糖有效, 不能用于O-连接的糖或者全新结构. 这个领域仍然迫切需要划时代的解决办法.

 

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