基因剔除

当基因转入破坏生物体基因组内某个基因后，观察由此引起的表型变化，同样也可认识基因的功能，这是基因剔除(gene knock-out)。基因剔除是用DNA重组技术剔除或破坏生物体基因组内某一特定基因，而后观察由此引起的表型改变。这样，可以了解该基因的生物学功能。现以小鼠为例，先将待剔除的基因制成缺失突变型，在缺失的位置上插入一个选择基因如新霉素抗性基因(neo)，同时再接上另一个选择基因如胸苷激酶基因(tk)。将这一段带有已失去原有功能的待剔除基因的DNA片段装在载体上，转入在体外培养的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)。在细胞内，通过同源重组将基因组里有功能的待剔除基因置换掉，也就是被剔除了。因为转入的外源DNA片段只有通过同源重组整合进基因组时，方能把片段上连接在待剔除基因旁边的选择基因丢掉。非同源重组也就是随机整合，则会把整个外源DNA片段包括已失去功能的待剔除基因序列和两个选择基因，全部插入ES细胞的基因组。此时，在体外培养ES细胞时，在培养液里加入针对两个选择基因的适当的化学物质，就可使随机整合(此时整个外源DNA包括neo和tk基因都被整合)而仍保留着待剔除基因的ES细胞被选择性地杀死；只有发生了同源重组(此时，tk基因不被整合)使待剔除基因被置换或剔除掉的ES细胞，方能选择性地存活下来。然后将这些存活的ES细胞注射进小鼠早期胚胎。由于ES细胞是二倍体细胞，所以已经剔除了待剔除基因的ES细胞是该基因的杂合子，也就是ES细胞的一对同源染色体中只有一条染色体上的等位基因被剔除了。所以这种ES细胞注入小鼠胚胎后产下的小鼠也是该基因的缺失杂合体，需要把同是该基因缺失杂合体的雌雄小鼠交配，从子代中选出该基因缺失的纯合体，其概率为四分之一。这些缺失纯合小鼠可用于研究鉴定被剔除基因的生物功能。