实验86 吸收光谱分析
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实验86 吸收光谱分析
光谱分析可以分为发射光谱分析和吸收光谱分析两大类。当构成物质的分子或原子受到激发而发光，产生的光谱称为发射光谱，发射光谱的谱线与组成物质的元素及其外围电子的结构有关。吸收光谱是指光通过物质被吸收后的光谱，吸收光谱则决定于物质的化学结构，与分子中的双键有关。各种物质由于具有不同的生色团（chromophore），如烯基，炔基，酮基，醛基，羧基，酰胺基，硝基，偶氮基等，因此也有不同的吸收光谱曲线。我们就可以利用吸收光谱来鉴定一些复杂的物质，如利用红外光谱进行物质结构的分析，也可利用吸收光谱的最大值进行定量分析。
Ⅰ．比色分析法
原理
比色分析法和分光光度法在植物生理学中应用十分广泛，由于它方法简便，分析速度快，灵敏度较化学容量分析和重量分析要高，所以乐为人们所采用。其基本原理是根据物质对光的吸收，吸收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系，这就是著名的兰伯特—比耳（Lambert－Beer）定律，它们之间的关系可用数学公式表示为：
IT =I0 ×10-KLC (1)
式中I0 为入射光强度，
IT 为透过光强度，
L为溶液的厚度，
C为溶液的浓度，
K为吸收系数，表示物质对光的吸收特性，不同物质K值不同。
份数，以T表示之，单位常用%。
A=KLC (2)
对于一定的溶质，K值是相同的，如果测定时溶液的厚度固定，即L不变，从(2)式可见，溶液的浓度C与吸光度A成正比例。所以只要测得吸光度A，就可以计算浓度C。用比色计就能很方便地测得吸光度A，仪器的读数盘上总有两项数目，一是等距离标尺的透射比T，另一是不等距离的对数标尺吸光度A，一般总是读取T，从附表9查得A，而不直接读取A，以减少读数误差。
滤光片的作用及选择
一般溶液对各种波长的光的吸收是不同的，只对很狭窄的一部分光波吸收最强，其他光波则通过溶液。滤光片的作用即在于使得光源来的各种波长的光，只让最容易被溶液吸收的光波通过，而滤去不被溶液吸收的光波，使光更接近单色性，使其更符合兰勃特—比耳定律，提高分析的灵敏度。为了要得到单色光可以在光源和溶液之间加一滤光片，因而选择合适的滤光片是很重要的，选择的原则是，滤光片透光度最大的波长，应该是溶液透光度最小的波长（即吸收最大的波长），滤光片的颜色应该是溶液的补色。下表可供选择滤光片时参考。
如果象581—G型比色计，只有3块滤光片，NO．42蓝色，NO．50绿色，NO．65红色，是绝对不会用错的。如果象72型和721型分光光度计，不用滤光片，代之以更精密的单色光器，则比色波长的选择，可根据溶液的吸收光谱曲线来决定。先行绘制比色溶液的吸收光谱曲线（方法可参照实验32），以出现最大吸收峰时的波长作为比色测定的波长。例如用
度计上测得吸收光谱曲线如图31，最大吸收峰位于520nm，以后比色时即用波长520nm。
此外，国产比色计或分光光度计，每台仪器都配有一盒比色杯，比色杯的光径有5、10、20、30、50mm等规格，以4只为一组，每组之间的透光性是比较一致的，不要和其他仪器上同光径的比色杯调用，如果要互用的话，应测量一下它们的透光性是否一致。每只比色杯的磨砂面上都标有一箭头，插入架子比色时，应面对箭头方向，以减少误差。最常用的为光径10mm的一种，也是标准比色杯。
绘制标准曲线
根据公式A＝KLC，K和L不变对，则吸光度A与溶液浓度C呈正比例关系。所以将浓度为Cs 的标准样品与浓度为Cx 的待测样品，放在两只光径相同的比色杯中（标准情况下使L=10mm），测得两溶液的吸光度分别为As 和Ax ，根据上式则它们之间有如下关系：
As ：Ax =Cs ：Cx (3)
这就是比色分析中最常用的一个运算公式，用以计算未知溶液的浓度。但公式的应用受溶质的性质和呈色反应的机理以及试验条件等影响，实用时特别是溶质浓度高时，就不完全符合公式。所以应用这一公式进行比色分析时，往往是用一系列不同浓度的标准溶液，在比色计上测得相应的吸光度A，然后在毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线（即A—C曲线），以后测定未知样品时，只要在同样条件下测得吸光度A，便可以在标准曲线上查得样品的浓度。但在绘制标准曲线时，不同浓度的吸光度值往往不会完全落在一条直线上，此时要决定直线的斜率就会感到困难，因此最好应用统计方法配以回归直线方程式Y=a bX，只要求得a和b（用具有统计模式的计算器很容易计算），方程式即可解。以后就可以利用此方程式进行计算，比查图要方便，也精确得多。
式中X为溶液的浓度，
Y为溶液的吸光度，
N为测定的项数，即所用标准溶液的数目，
a为直线在Y轴上的截距，
b为直线的斜率。
绘制标准曲线时的试验条件及步骤，也就是以后进行比色分析时的标准。选择确定条件时，应特别注意：生色的条件、颜色的稳定性、线性浓度范围以及比色波长等。生色的条件是与反应机理有关的问题，而温度对反应速度的影响是很显著的，应该十分重视反应时温度的高低。
的时间内高温下所产生的颜色可以1倍于低温下所产生的颜色，因此不同温度下标准曲线的斜率也就不同，灵敏度也就不同了。
光、温度等关系密切，也应注意。线性浓度范围则由于不同的物质和所用的方法而异。
Ⅱ．紫外和可见分光光度分析
原理
在比色分析中的入射光源是通过滤光片，得到波长范围较宽的重点单色光，如果用单色光器代替滤光片，得到了波长范围更为狭窄的单色光，作为入射光源，使更符合Lambert—Beer定律，大大地提高分析灵敏度，扩大了它的应用范围，这就是分光光度法。在可见光区此时的分光光度计实际上可以看作是一个波长可调、具有高分辨率和高灵敏度的高级类型比色计。如果采用合适的光源和分光器，还可以将波长范围扩大到紫外光区和红外光区。相应地就有紫外分光光度分析和红外分光光度分析。
各种物质由于其分子结构不同，它们的吸收光谱曲线也有其特殊的形状，我们就可以利用物质的特征吸收峰，对该物质进行定量分析，而不必将它从混合物中分离，这就大大地简化了测定手续，特别是要分析混合物中两个或两个以上组分时，尤为方便，这是一般比色分析所不能达到的。用分光光度法测定叶绿素a和b，就是我们熟悉的一个例子。
测定单一组分
如果溶液中只有一个组分，而该组分有一明显的吸收峰，如图34ATP在pH=2的溶液中的最大吸收峰为257nm，只要将未知浓度的ATP溶液，在分光光度计波长257nm时测得吸光度A，然后根据公式即可进行计算。
根据公式(3)，有如下关系：
式中Cs 和Cx 分别为标准样品和未知样品的浓度。
As 和Ax 分别为标准样品和未知样品的吸光度。
如果浓度的单位为摩尔浓度，例如Cs =1mol/L，而溶液的厚度为1cm，则此时的吸光度A称为摩尔吸收系数，以ε表示之，则As =ε，所以上式即成为：
式中摩尔吸收系数ε，系指某物质当浓度为1mol/L时，比色杯光径（即溶液厚度）为1cm，在它的最大吸收波长λmax 下测得的吸光度值，文献上常以εmax 表示之。
从(4)式可见，只要知道某一物质的εmax ，并测得其未知浓度溶液的Ax ，则未知样品的浓度Cx ，即可以计算得到。而摩尔吸收系数ε可以从生化手册或文献中查到，附表10即为核苷类化合物的光谱数据。
一般应用公式(4)作分光光度分析，有时也用比吸收系数k代替摩尔吸收系数ε，则式(4)可改写为下列形式：
k的含义为，某物质的浓度以%为单位，比色杯光径为1cm，在最大吸收波长λmax 时的吸光度A，称为比吸收系数k。
应用ε或k，虽然没有标准样品，都能进行分析测定，但应该注意的是应用公式(4)或(5)进行分光光度分析时，测试的条件必须与测定ε或k时完全一致。但实际上往往不能做到完全一致，所以最好还是用标准样品，在试验条件下，求得ε或k值，以后未知样品就在这样的条件下进行测定。
测定两个组分
如果要测定混合液中两个组分时，倘若它们的吸收峰有着明显的差异，彼此又不发生干扰，这时就可以象分析单一组分一样进行测定。如图35为两种化合物S和R的吸收光谱曲线，它们的吸收峰分别在420nm和565nm，吸收峰彼此独立，不产生干扰，这时就可以象测定单一组分一样进行分析。值得注意的是，由于S在420nm的吸收峰较陡，测定时波长稍有不正确就会带来很大的误差，在这种情况下还不如利用较平坦的肩峰450nm进行测定，就不会因为波长不准确引起误差了。R化合物的565nm吸收峰较平圆，情况就要好得多了。
一般情况下两个组分的吸收峰彼此不产生影响的情况是少见的，通常情况往往是吸收峰彼此总有些重叠，如图9中叶绿素a和b的吸收光谱曲线，在叶绿素a的吸收峰位置（663nm），叶绿素b也有吸收，同样在叶绿素b的吸收峰位置（645nm），叶绿素a也有吸收，彼此产生干扰。在这种情况下，需要通过代数方法，计算一种组分由于另一组分存在时的吸收作用。其方法是需要在两种波长下（一般为这两种组分的最大吸收峰波长），测定混合液的吸光度，然后通过计算，即可以得到混合液中这两种组分各自的含量。
设选用的两个波长分别为λ1 和λ2 ，组分a和b在波长λ1 时的吸光度分别为Aa1 和Ab1 ，在波长λ2 时的吸光度分别为Aa2 和Ab2 。a和b的浓度分别为Ca 和Cb ，若浓度为摩尔浓度，则组分a和b在波长λ1 时的摩尔吸收系数，分别为εa1 和εb1 ，同样在λ2 时的摩尔吸收系数为εa2 和εb2 ，同样道理其比吸收系数则分别为ka1 、kb1 、ka2 和kb2 。
根据公式(4)，在波长λ1 时则有：
Aa l=Ca ·εa1
Ab1 =Cb ·εb1
根据公式(5)，则有：
Aa1 =Ca ·Ka1
Ab1 =Cb ·Kb1
同样在波长λ2 时，则有：
Aa2 =Ca ·εa2
Ab2 =Cb ·εb2
或 Aa2 =Ca ·Ka2
Ab2 =Cb ·Kb2
如果我们在试验中测得混合液在波长λ1 和λ2 的吸光度分别为A1 和A2 ，代入上面式子，则得：
A1 =Aa1 Ab1 =Ca ·εa1 Cb ·εb1
A2 =Aa2 Ab2 =Ca ·εa2 Cb ·εb2
经过整理，则得：
公式(6)(7)即为最后的计算公式。如以比吸收系数k代替摩尔吸收系数ε，公式(6)(7)同样成立。A1 和A2 是可以在试验中测得的吸光度，ε可从文献上查到，因而浓度Ca 和Cb 即可计算得到。
今以叶绿素a和b公式的计算举例如下：
从文献(4)中查到80%丙酮溶液1000ml中含有叶绿素a或b1g时，比吸收系数k值为：
此时λ1 为663nm，λ2 为645nm，ka1 =82.04，ka2 =16.75，kb1 =9.27，kb2 =45.60，代入公式(6)(7)经简化后即得到：
Ca =0.0127 A663 —0.00269 A645 (8)
Cb =0.0229 A645 —0.00468 A663 (9)
公式(8)(9)就是著名的Arnon的计算公式（计算得到的实际系数与该式稍有出入，但对结果无多大影响）。
