抗癌基因 antioncogene

抗癌基因 也称为肿瘤抑制物。现在共发现了 10 种抗癌基因，其中研究得较为深入的是人的 Rb(Retinoblastoma 视网膜母细胞瘤 ) 和 p53 蛋白。

Kundson 早在 1971 年根据对遗传性和散发性视网膜母细胞瘤患者的调查研究，提出著名的“二次突变假设（ two mutation hypothsis ）”。认为视网膜母细胞变成瘤细胞必须要经过二次突变。第一次突变存在或发生于上一代的生殖细胞中，则患儿的体细胞已有了一次遗传下来的突变，只要在视网膜母细胞内发生条二次突变就可致癌。后来遗传学家发现家族性患儿的体细胞中 13 号染色体存在缺失（ 13q14 ），表明该区域可能存在与视网膜母细胞瘤发生有关的基因 Rb 。接着 Sparkes(1980) 将 Rb 基因定位于 13q14 。 Benedict （ 1983 ）提出位于 13q14 的 Rb 的一对等位基因均失活才会产生该肿瘤。表明 Rb 是以隐性方式起作用。而与开始认为 Rb 为显性遗传的观点不同。现已证实 Rb 的作用确为隐性的。 Stephe 等（ 1986 ）开始构建了人的 13 号染色体的λ噬菌体文库，其中 1.5Kb 的 DNA 片段和 Rb 有关。接着又分离到一个 30Kb 的 cDNA 片段，用此片段可检测到 13q14 带 70Kb 区域的基因。这对分离和克隆 Rb 是至关重要的。同年眼科专家 Dryja 发现 Rb 失活时可以致瘤，杂合子（ Rb /Rb^- ）易被诱变而失活，此完全符合二次突变学说和隐性遗传的假设。他还发现经眼球摘除手术能存活下来的患儿长大后易患成骨肉瘤，乳腺癌和小细胞肺癌，当时这是一个谜。现在已和 Rb 广泛的抑癌作用有关。 1986 年 Friend13q14 位点的 Rb 经 cDNA 克隆制各成探针，检查很多例骨肉瘤和组织肉瘤患者发现约 50% 的患者 Rb 基因纯合缺失。这意味着 Rb 具有抑制的作用。为了证实这个问题 1987 年加州大学欧文分校的 Stanbridge 等分离了人类 13 号染色体，将它注入培养的成骨肉瘤细胞中，结果导致了癌细胞逆转，同年加州大学圣地亚哥分校的李文华把 Rb 转化到培养的癌细胞中使其逆转。更进一步证明了 Rb 的抑癌作用。他克隆了 Rb 全长的 cDNA ，发现其产物是一种长 928 氨基酸，分子量为 105Kda 的蛋白质。

 

Rb 的分子功能是什么呢？它主要是可以和其它各种蛋白相互作用，其中包括肿瘤抗原： SV40 T 抗原，腺病毒 E1A 抗原，人类乳头瘤病毒 E7 抗原，可结合到 RB 的 379~792 残基区域。一种可能是部分致癌蛋白由于和 RB 产物的相互作用其致癌的作用受到了抑制。另外 RB 还有抑制细胞增殖的作用。

 

RB 是一种 105Kb 的核内磷蛋白，它对细胞周期也有一定的影响。保持在 G0/G1 期的静止期细胞中 RB 是未磷酸化的，在细胞周期中它被周期蛋白 CDK （ cyclin-CDK ）复合物磷酸化。大部分情况是发生在 G1 期末，一直延伸到 G2 期末，在有些分裂中是去磷酸化。 RB 在非磷酸化状态才能和几种蛋白如 SV40 T 抗原等特异结合。这些相互作用只发生在细胞同期的特定阶段（在 S 期前） RB- 经磷酸化就会释放这些蛋白。

靶蛋白中包括一组 E2F 转录因子，它们所激活转录的靶基因其产物是 S 期所必须的。和 RB 结合以后 E2F 的激活转录的能力受到抑制，表明 RB 可以阻遏那些依赖 E2F 的基因的表达。通过这种途径 RB 可直接阻止细胞进入 S 期。而 RB-E2F 的复合体也可直接阻遏某些靶基因。因此 E2F 从 RB 上解离以后这些基因才能表达。

一些病毒的肿瘤抗原特异地与非磷酸化形式的 RB 结合，研究得最多的是 SV40 T 抗原和腺病毒的 E1A 。非磷酸化的 RB 可以阻止细胞的扩增。为了要使细胞周期得以进行必须要阻遏 RB 的活性。其途径就是周期蛋白使 RB 磷酸化。当肿瘤蛋白和非磷酸化的 RB 结合时也能抑制其活性。由于 RB- 肿瘤复合物不再和 E2F 结合，使 E2F 得以游离进入 S 期，可活化 S 期需要的一些基因。

RB 的过量表达妨碍细胞生长。丢失了 Rb 骨肉瘤细胞株的特点就表明了 RB 对于抑制细胞扩增的重要性。当将 RB 转导到此细胞株中其生长就被抑制了。然而这种抑制作用又可被 D cyclin 的表达所解除。这是由于 D-cyelin 所形成的 cdk-cyclin 复合体可使 RB 磷酸化。 p107 和 p103 也是和 RB 同一类型的蛋白，它们具有相关的顺序和相同的和特点。

几种细胞周期的调节蛋白在肿瘤中被发现是突变失活的，因而被认为是肿瘤的抑制物。除了 RB 以外还有一些小的抑制蛋白（最引人注意的 p16 和可能性大的 p21 ）及 D cyclin 。虽然这些蛋白（最著名的是 RB ）在增殖细胞周期中所起的作用与致瘤有关，这大部分是在静止（ G0 期）细胞中发现的。在静止细胞中 RB 是未被磷酸化， Dcyclin 的水平是低的或者缺如， p16 ， p21 和 p27 蛋白使 cdk-cyclin 失活。

p21(cip1/wAF1),p27(Kip1) 和 p15/p16 （ ink4 ）合称为Cki 蛋白 ，它们结合在 cdk-cyclin 二聚体上，使其失活。如在静止期通过这种途径阻止 RB 的磷酸化，使细胞周期不能进入 S 期。

p15/p16 是由两个相邻的基因编码，二者密切相关。 p16 可特异地结合于 cdk4 和 cdk6 ，表明它们与 G0/G1 期的过度相关。 p16 不能抑制丢失了 RB 细胞的增殖，表明它的功能是阻止 cdk-cyclin 使 RB 磷酸化， p16 通过和 cdk 亚基的结合还可抑制 cdk4-cyclin D 及 cdk6-cyclin D 的装配，也可能抑制了它们的激酶活性。

p21 是一种通用的 cdk 抑制物，结合所有的 cdk2 、 4 、 6 复合体，表明它是通过 G1/S 各阶段来阻断过度。前期培养细胞（直接取自动物的细胞）中的 cdk-cyclin 二聚体常以一种四聚体的形式存在，其实是结合了另外 2 种蛋白：一是 PCNA ，此是真核 DNA 聚合酶δ的成份，和复制有关；另一个则是抑制物 p21 。在转化细胞中 cdk-cyclin 复合体丢失了 p21 和 PCNA ，表明 p21 可能涉及到 G1/S 过渡的控制。

p27 蛋白有一段顺序和 p21 部分同源。也能混杂地和 cdk-cyclin 复合物相结合。 p27 的过量表达可阻断 S 期的过度。当细胞用 TGF b 来处理，细胞进入静止期时 p27 的水平增加。 p21 和 p27 阻断 cdk-cyclin 二聚体的催化亚基被 CAK （ cdc2-activation kinase ）磷酸化而激活。它们也阻止 cdk-cyclin 复合体的催化活性。

p53 基因是一种肿瘤的抑制物，但在 Li-Fraumeni 综合征中是作为常染色体显性遗传的，这种综合征是一种罕见的遗传性癌，患者可在不同组织中出现癌。此是由于 p53 基因发生错义突变。由于突变使 p53 的结构改变，产生了新的特性，这就解释了长期以来认为它和致癌有关的一些现象。

p53 也是一种核内的磷蛋白。是最主要的肿瘤抑制物，人类一半以上的癌都显示出或是 p53 蛋白的缺失，就是 p53 基因的突变。它开始是在 SV40- 转化细胞中发现与 T 抗原相结合。在很多转化细胞或肿瘤细胞系中发现 p53 蛋白的量大大增加。在早期实验中发现克隆的 p53 会导致细胞无限制生长，因此把 p53 作为一种癌基因，通常它的作用是显性的。

所有的 p53 的转化形式都是此蛋白的突变形式。它们成为一种显性失活突变体，其功能掩盖了野生型蛋白的功能阻止它发挥作用。显性失活突变大部分的共同形式是形成一种异聚体蛋白，它含有突变型亚基和野生型亚基。在异聚体中野生型亚基是没有功能的。 p53 可能以四聚体的形式存在。当 p53 突变型亚基和野生型亚结合时，此四聚体呈现突变体构象。若缺失了一对等位基因，或者有一个基因发生显性实变，失去了限制的功能，细胞都可以无限生长。

从分子水平来看 p53 的功能是什么呢？此有两种学说。（ 1 ） p53 被发现时是以 SV40 病毒的大 T 肿瘤抗原的结合蛋白存在的，它能与 T 抗原结合这是野生型 p53 蛋白的特点，而突变型 p53 是不能和 T 抗原结合的。野生型 p53 与 T 抗原的结合干扰了 T 抗原在 SV40 DNA 复制中启动作用。一种可能是野生型 p53 与细胞中某些 T 抗原的类似的物结合，抑制了它们的活性，但在 p53 突变体中就失去这种功能。（ 2 ） p53 也是一种 DNA 结合蛋白，它能识别长 10bp 两侧对称的模体，并激活含多拷贝这种基序的启动子的转录。在有的座位上它可能阻遏其靶基因。 p53 通过调节基因的表达来控制细胞周期，缺乏这种调节就会导致细胞无限制生长。

大部分 p53 的错义突变位点在很多生物中都是保守的。表明突变可能干扰了某种保守的功能。 p53 突变体产生了一些新的特点包括（ 1 ）其半衰期从 20 分钟增加到几小时；（ 2 ）构象发生改变，此可用其抗体来测定；（ 3 ）改变了它从核到细胞质的定位；（ 4 ）不再和 SV40 T 抗原结合；（ 5 ）不再和 DNA10bp 的模体结合。

在所有正常的细胞中 p53 的水平是低的。但当 DNA 通过照光或其它处理而发生损伤时 p53 被激活，导致 p53 大量增加， p53 的活化可以引发两类效应。细胞停止生长或萎缩直至死亡。图 19-7 表明细胞在 G1 的早期 p53 触发细胞周期的限制点，阻断了细胞周期的进程，此是通过诱导 p21 对 CDK-cyclin 激酶的抑制来实现的（图 19-4 ），使损伤的 DNA 在细胞进入 S 期前得到修复的机会。但若细胞已进入分裂期，那么 p53 就触动细胞死亡的程序。这种萎缩（ apoptosis ）的典型结果是细胞坍缩成一个异固缩的小团以及核 DNA 断裂。

 

 

 

p53 有多种分子活性

（1） p53 是一种 DNA 结合蛋白，可识别 10bp 的回文模体，其第 120-290 位氨基酸的区域负责这种与特定靶顺序的结合。

（2） 可激活含多拷贝模体启动子转录。在其 N 端第 1-42 位氨基酸区域承担此激活转录活性。 p53 还可以阻遏某些不含有以上模体的基因，其机制不明。

（3） p53 也能和损伤的 DNA 结合（第 310-390 位），此 C- 端的功能区可以识别单链 DNA 区。

（4） p53 是一个四聚体，其寡聚化对于其突变体具有的显性失活调控的作用是先决条件，若不形成四聚体，那么一个分子的突变就难以影响到整个四聚体构象的改变而失去功能。

当 p53 作为转录因子时用它的第 120-290 位功能域与靶顺序结合。 N- 端的激活功能域直接与 TBP （ TATA box-binding protin ）相互作用。此区域也是其它与其相互作用蛋白的靶位点，包括细胞蛋白 mdm 2 和腺病毒的癌蛋白 E1B （ 55KD ）。 mdm 2 是一种细胞蛋白，它通过和 p53 N- 端结合，抑制其活性，阻断转录。 p53 诱导 mdm 2 的转录，这样它们之间的相互作用形成了负反馈，限制了彼此的活性。

和 E1B 55KD 蛋白的相互作用使得腺病毒阻断 p53 转录活性。 p53 其它的区域可以成为抑制作用的靶位点； SV40 抗原结合到 p53 特异 DNA 结合区，这样阻止了它识别靶基因。

p53 的功能是作为一种转录因子，激活一系列的基因，包括 p21 （抑制细胞周期，只执行 G1 限制点所必要的）， GADD45 （一种修复蛋白，它也可通过对照射损伤作出反应而被激活）；这两个基因都涉及到细胞周期的制止。从这两个基因和其它靶基因的激活，看来似乎意味着 p53 使生长停止。

p53 突变的细胞有新增加的特点，即 DNA 扩增，此可能导致癌细胞中所发现的基因组不稳定的特点。

p53 的 C- 端可以和非特异顺序的短单链 DNA 区（ < 40b ）相结合。由于很短的（ 1-3b ）缺失及插入而产生的错配区域相结合。这样的靶是由 DNA 的损伤所产生的。相互作用的结果激活了特定功能区的特异顺序结合活性，所以 p53 可以刺激靶基因的转录。这种连接的特点并不清楚。可能要经过二个阶段。当 p53 通过 C- 端功能区和 DNA 损伤位点结合时，其性质发生改变然后与损伤位点解离，结合到靶基因上，将它激活。

p53 触发细胞萎缩的能力尚缺乏了解，此与转录靶基因的能力之间不存在相关性。腺病毒 E1B （ 19KD ）蛋白可阻断 p53 萎缩细胞的活性，但并不阻断其激活靶基因的活性。 p53 独立于制止生长之外的萎缩细胞的这一功能是通过 E1B 55KD 蛋白能阻断转录活性而不影响萎缩而引起人们的关注。有可能 p53 通过别的途径来触发萎缩，而不涉及靶基因的激活。

肿瘤的发生和萎缩的缺乏二者之间关系的重要性是通过 bcl 2 onc 显示出来的。 bcl 2 原来被鉴定为一种靶基因，它在某些肿瘤中通过易位而被激活，结果异清楚它是具有抑制萎缩各种途径的特点。表明萎缩在抑制肿瘤形成中起到一种重要的作用。可能由于它消除了潜在的致瘤细胞。当 bcl 2 被激进阻止了萎缩，使这些细胞免于死亡。

带有 p53 功能缺陷的细胞具有多种表型；这种多效性使得难以决定它的这些效应与肿瘤抑制功能之间的直接联系，关于 p53 作用的大部分知识是来自于其被激活的情形。我们推测它触发制止生长或萎缩是和它抑制肿瘤的能力有关。很显然 p53 对 DNA 损伤若缺乏反应将会增加细胞对致癌性突变的易感性。但我们不知道 p53 是否是唯一的作用。我们不知道在正常情况下当 p53 未被 DNA 损伤激活时它可能起到什么作用。 p53^- 小鼠能够正常的存活表明 p53 的作用对于发育来说并不是必要的。

RB 和 p53 的特点表明二者是肿瘤的抑制物，它们以某种方式控制细胞的增殖，若缺乏二者就会失去这种控制而导致肿瘤的形成。这两种蛋白都具有与细胞周期相关的功能，当它们为活性状态时可抑制肿瘤，失去它们细胞就会无限生长。