分子杂交 molecular hybridization

互联网2013-11-14

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分子杂交是用一个 DNA 单链或 RNA 单链与另一被测 DNA 单链形成双链，以测定某特异顺序是否存在。这种方法已成为遗传学和分子生物学等生命学科中最为普遍和重要的方法之一。分子杂交的方法多种多样，但其共同特点是： (1) 都是应用复性动力学原理； (2) 都必须有探针（ probe ）的存在。所谓探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异 DNA 或 RNA 顺序。我们常用的分子杂交方法有以下几种：

一 原位分子杂交（ in situ hybridization ）

原位分子杂交有两种，一种是玻片原位杂交，另一种是膜上原位杂交。玻片原位杂交一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等，片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱，若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复盖上一张同样大小 X 光片进行放射自显影，然后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位置。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。近年来已发展了多色荧光技术，同时可用不同的探针来进行杂交。这种方法可用来进行染色体的基因定位，或观察组织中不同的 RNA 的分布。果蝇早期的发育中，不同基因的控制就采用了这种方法进行研究。

膜上分子杂交是将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），这种膜只吸附单连 DNA 。将影印好的膜用 NaOH 处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使 DNA 变性吸附在膜上，然后用无关的单链 DNA ，如常用小牛胸腺 DNA 和鲑鱼精子 DNA 吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果，膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。这种方法常用来从基因文库（ gene bank 或 gene library ）中来钓基因。

二 斑点杂交（ dot blotting ）

斑点杂交也叫狭缝杂交。是由 Southern blot 衍生而来。方法是将某种生物的总 DNA 直接点滴在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分析 DNA 样品之间的同源性此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做 Southern blotting 加以验证。

三 . 萨瑟杂交

萨瑟杂交是 southern,E.M 于 1975 年首先建立的，故称为 Southern 杂交，该方法经萨瑟印迹法将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和 DNA 探针杂交，用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片段长度的多态性，及动物园吸印（ Zoo blot ）（用一个物种的 DNA 探针和别种动物的 DNA 进行 Southern blotting ）等。

四 . 诺瑟杂交（ Northern hybridization ）

Northern 杂交的技术和 Southern 杂交相似，作者并不姓“ Northern ”，因“ Southern ”意为“南方”，故戏称自己的分析方法为“北方”“（ Northern ）杂交。 Northern 杂交与 Southern 杂交主要的不同之处在于检验 RNA ，而不是 DNA 。首先是提取某种生物或组织的总 RNA 或 mRNA ，然后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离 RNA ，变性剂的作用是防止 RNA 自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的 RNA 带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。

五 . Western blotting

既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随之而来的就是“西方”杂交（ Western blotting ），但 Western blotting 和前面的几种杂交都不相同，它是用来测蛋白而不是检测核酸，在此一并简单介绍一下，此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质技术。

六 . 电镜观察

先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含子的探测以及缺失的确定等。断裂基因就是用这种方法发现的。电镜观察有二种，一是异源双链定位法（ Heferoduplex mapping ），二是 R- 环定位法（ R-loop mapping ）将异源 DNA 双链变性后进行分子杂交，然后制电在电镜下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。 R- 环法是将标记的 mRNA 和变性后的待测双链 DNA 进行杂交，制片后，可以观察到 R- 环，这是由于 RNA 形成的双链比原来的 DNA 双链更为稳定，将一条 DNA 单链置换了出来，表明该 mRNA 基因就位于 R- 环这个位置。