功能基因的反义核酸筛选技术

反义核酸技术 (antisense technology) 主要包括反义 RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotide) , 可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达 , 用来快速、有效地测定基因功能。

 

 

RNA 干扰技术

 

天然反义 RNA 广泛存在于原核和真核细胞内 , 通过与靶基因形成 RNA - RNA 或 RNA - DNA 双螺旋 , 对基因功能起重要的调节作用。 RNA 干扰技术 (RNA interference ,RNAi) 正是利用了反义 RNA 与正链 RNA 形成双链 RNA , 特异性抑制靶基因转录后表达这一原理 , 成为研究转录后调控的有效工具 , 广泛用于功能基因组学、基因治疗和转录调控机制研究 。在这一技术中 , 早期使用双链 RNA (double - strand RNA , dsRNA) 作为干扰剂 , 核心技术是小分子干扰 RNA( small interfering RNA , siRNA) 的设计与合成 ( 哺乳动物通常选择 21 ～ 23 bp dsRNA , 其他生物选择更长的片段 ) , 另外 , 还包括 siRNA 的标记、转染和 RNAi 的检测。

 

然而 , 基因敲除实验显示 RNAi 存在一定程度的非特异性。分析认为 ,RNAi 最初在哺乳动物细胞中所获得的成功 , 部分是由于所使用的短链 dsRNA 激活了胞内 dsRNA 依赖的蛋白激酶 , 引起细胞反应并不断累积。新近两方面技术的发展使得 RNAi 在哺乳动物细胞中更加奏效 : (1) 使用能使 siRNA 稳定表达的新的载体系统 [21 ] ; (2) 利用人 U6 核内小 RNA ( snRNA) 启动子进行单一 RNA 转录单位的核内表达 [22 ] 。即通过转染 dsRNA 的胞内表达并在胞内降解成约 20 bp 的 dsRNA , 后者通过 RNA 依赖的 RNA 合成酶复制 , 并结合到核酸酶复合物上 , 形成 RNA 诱导的转录沉默复合体 (RNA - induced silencing complex ,RISC) , 降解靶 mRNA 。

 

 

反义寡核苷酸

 

反义寡核苷酸主要通过 RNase H 介导的机制抑制基因表达。 RNase H 是一种降解 RNA 2 DNA 杂交链中 RNA 的酶 , 产生 5 ′ - 磷酸和 3 ′ - OH 端。 RNase H 酶切产物因缺少 5 ′ - cap 和 3 ′ - poly A 尾而被细胞中的 5 ′和 3 ′外切酶降解。这种高效的方法已被广泛用于含有反义寡核苷酸序列样的靶基因的下调 ( down regulation) 。实际上 , 这种技术对于鉴定 mRNA 中的有效靶基因在某种程度上靠经验 , 因为许多靶基因不能显示最佳活性。可以通过增加反义寡核苷酸的种类克服这种局限 , 如在 96 孔板上进行 PCR 后 , 同时使用 80 种以上的反义寡核苷酸进行同一个 mRNA 表达的研究。整个过程仅用 4 ～ 5 d 。因此 , 这是一种高通量的基因功能检定方法 [16 ] 。化学修饰如 2 ′ - 甲氧基乙基化〔 2 ′ - O - (2 - methoxy) ethyl ,2 ′ - MOE 〕可降低细胞中核酸酶对寡核苷酸的降解作用 , 因而得到越来越多的研究应用。反义寡核苷酸技术已被用于多种系统的基因功能研究 , 如蛋白磷酸化酶、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂 p27/ kip (cyclin - dependent kinase inhibitor p27/ kip) 、凋亡蛋白抑制剂 survivin 和抗凋亡蛋白 BCL - XL 。反义技术广泛用于体内外模型中靶基因功能的验证 , 可部分替代基因敲除技术。