琼脂扩散试验（gel diffusion test）

可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。
（一）双向琼脂扩散试验（Double immunodiffusion test）
抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

【材料】羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。

【方法】
1、用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。
2、待琼脂凝固后，按右图用打 孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂 （孔距为5mm）。
3、在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。
4、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

【结果】
观察孔间沉淀线的数目与特征，一般可注意到以下几种现象：
1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线，说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合，如出现数条沉淀线，说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合。
2、根据抗原的成份可有以下三种现象：（1）若二孔中的抗原相同，与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形；（2）若二孔中抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则形成的沉淀线相交叉；（3）若两孔中抗原部分相同，抗血清中有各相应的抗体，形成的沉淀线相切。

3、相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一侧

（二）单向琼脂扩散试验（Single immunodiffusion test）―人血清中IgG、IgA、IgM的测定。
单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。本试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量。

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材料】
IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器（10微升）、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。

【方法】

1、免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂（用PH8.2、0.05M的巴比妥缓冲液配成），加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清（抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度），混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。

2、稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。

3、加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。
4、扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，（如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察），必要时可以染色后观察。
5、绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法：
（1）Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d² ＝K（C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数）。
（2）Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间（24小时）扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K（C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数）。

【结果】免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批号的参考血清其免疫球蛋白含量不一。