小鼠IgM定量EIA试剂盒使用说明
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小鼠<font>IgM</font> <font>定量</font> EIA 试剂盒使用说明
原理
本实验采用双抗体夹心 ELISA 法。用抗小鼠 IgM 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 IgM 与单抗结合,加入酶标抗体,形成免疫复合物连接在板上,加入酶底物<font>TMB</font> <font>,出现蓝色,加终止液硫酸,颜色变黄,在</font> 4 50 nm 处测 OD 值,<font>IgM</font> <font>浓度与</font> OD 值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中<font>IgM</font> <font>浓度。</font>
试剂盒组成 ( 2-8 ℃保存)
酶标 板 (<font>Coated Wells</font> <font>)</font> |
96 孔 |
酶标抗体工作液(<font>Enzyme Conjugate</font> <font>)</font> |
12ml |
10<font>×标本稀释液(</font> <font>Sample Buffer</font> <font>)</font> |
12ml |
20<font>×浓缩洗涤液(</font> <font>Wash Buffer</font> <font>)</font> |
50ml |
标准品 (<font>Standards</font> <font>)</font> : 5ug/<font>瓶</font> |
2 瓶 |
底物工作液(<font>TMB Solution</font> <font>)</font> |
12ml |
封板纸 |
一张 |
终止液 (<font>Stop Solution</font> <font>)</font> |
12ml |
准备试剂与收集血样
1. 收集标本:血清、血浆(<font>EDTA</font> <font>、肝素抗凝)、细胞培养上清液、尿液等尽早检测,</font> 2-8 ℃ 保存<font>48</font> <font>小时;更长时间须冷冻(</font> -20 ℃<font>或</font> <font>-70</font> ℃ )保存,避免反复冻融。 血清或血浆至少做<font>1</font> <font>:</font> <font>10000</font> <font>倍稀释。</font>
2. 标准品液配制:使用前加入<font>0.5ml</font> <font>蒸馏水</font> 混匀,配成 1000 0ng/ml 的溶液 。 设标准 管 8 管,第一管加标本稀释液 900ul ,第二至第八管加入标本稀释液 500ul 。在第一管中加入 1000 0ng/ml 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul ,移至第二 管 。如此反复作对倍稀释,从第七 管 中吸出 500ul 弃去。第八 管 为空白对照。
3. 10<font>×</font> 标本稀释液用蒸馏水作 1: 1 0 倍稀释( 示例: 1ml<font>浓稀释液</font> <font>+9ml</font> <font>蒸馏水)。</font>
4. 洗涤液:用重蒸水 1:20 稀释(示例:<font>1ml</font> <font>浓缩洗涤液加入</font> <font>19ml</font> <font>的重蒸水)</font>
检测程序
1. 加样:每孔各加入标准品或待测样品 100ul ,将反应板充分混匀后置 37 ℃ 12 0 分钟。
2. 洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次,向滤纸上印干。。
3. 每孔加酶标抗体工作液<font>100ul</font> <font>。将反应板置</font> 37 ℃ 6 0 分钟。
4. 洗板:同前。
5. 每孔加入底物工作液<font>100ul</font> <font>,置</font> 37 ℃ 暗处反应<font>15</font> <font>分钟。</font>
6. 每孔加入<font>100ul</font> <font>终止液混匀。</font>
7. 30<font>分钟内用酶标仪在</font> 45 0 nm 处测 吸光值。
结果计算与判断
1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品<font>1000</font> <font>、</font> 500 、 250 、 125 、 62 、 31 、<font>15.6</font> <font>、</font> 0 ng /ml 为横坐标, OD 值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。
3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 IgM 含量 ,再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能
1. 灵敏度 : 最小的<font>IgM </font> <font>检测浓度小于</font> 8n g/ml<font>。</font>
2. 特异性: 可同时检测重组或天然的小鼠 IgM 。 不与 小鼠其它细胞因子有交叉反应。
3. 重复性:板内、板见变异系数均小于10%。
注意事项
1. 以上标准孔及待 测 样品均建议做复孔,每次测定应同时 做 标准曲线。
2. <font>洗涤过程</font> 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。
3. 板条开封后剩余板条要再封好,保持 板条干燥 。
4. <font>本试剂盒宜置</font> <font>4</font> o C<font>冰箱保存。</font>
5. 本试剂盒仅用于科研,不能用于临床诊断!