PCR技术应用十：HIV感染

 

 

　　八十年代以来由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其严重的危害性而受到人们高度重视，力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在.聚合酶链反应(PCR)具有敏感、特异和快速的特点，是检测病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具.

一、HIV的基因结构

　　HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等.其中前三者为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性.第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达.第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变，缺失或插入引起的，高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性.目前已知HIV有两个型，HIV-1是从欧洲和美洲分离毒株的总称，亚洲地区的流行株也基本上为HIV-1，HIV-2是从西非的妓女分离的毒株.

二、PCR在鉴定HIV感染中的意义

　　HIV常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个细胞中仅以很低的DNA拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而又特异的HIV检测方法.传统的检测途经很多，包括外周血抗原测定，病毒分离和逆转录酶法等，但均费时费力，稳定性也差.核酸杂交虽有一定的特异性，敏感性却较低，利用原位杂交发现AIDS患者仅有104～105之一的细胞有含有HIV-1DNA，实际上远不至此.聚合酶链反应被称为无细胞的分子克隆技术(cell-free molecular cloning)，自1987年即被用于AIDS的研究中.Ou利用针对HIV-1LTR，gag和env基因的三对引物对HIV血清学和病毒分离均阳性与血清学阳性，但病毒分离阴性的男性同性恋者进行外周血单个核细胞(PBMC)前病毒DNA序列的测定，发现前者的阳性率为100%，后者也可达60%，对照组则均为阴性，因此提出PCR可以作为病毒分离的替代方法.Imagawa将PCR与其他几种传统方法进行比较，结果在分离出HIV-1前，具有血清阳转的4例男性中3例可用PCR检测出外周血淋巴细胞中gag基因的存在，这种阳性反应可发生在血清阳转前38～42个月，而在得出PCR阳性结果前，无一例分离出病毒，因而认为，对仍从事高危活动(如吸毒、同性恋等)的血清阳性个体，PCR能有效地发现HIV感染者的存在.此外，临床上AIDS患者常出现神经症状，而在许多血清学阳性个体的脑脊液(CSF)中却未分离出HIV-1，因而难以确定病毒的侵袭范围.利用PCR技术已经证实了CSF中存在着前病毒DNA和游离病毒RNA序列，而且RNA量似乎比DNA更为丰富.至于CSF中病毒序列的存在是否与神经系统的损害有关，目前仍存在不同意见，但至少无症状感染者CSF中HIV-1的存在对阐明与HIV-1相关的神经损害具有重要意义.

　　研究表明，HIV感染的女性所生的婴儿中有30～59%可在宫内、分娩过程或产后哺乳期感染该病毒，但由于婴儿体内存在来自母体的抗体且可持续15个月左右，同时又缺乏检测IgM型抗体的手段等原因，使得传统方法在鉴定新生儿是否感染方面受到限制，及时地对新生儿作出诊断，对于其获得早期治疗具有积极的意义.PCR技术所需标本量少，对新生儿、婴儿的诊断尤为适用.Roger用PCR对血清阳性母亲所生的23例儿童从新生儿开始进行外周血前病毒DNA的跟踪监测，结果表明，在后来发展为AIDS的7例儿童中，有5例在新生儿期即存在病毒序列，而血P24抗原却检测不到;具有AIDS非特异表现者，也有4/14在新生儿期呈阳性PCR反应;由这些母亲所生的健康儿童和阴性对照组则均为阴性，说明本方法的特异性和灵敏性极高.Soeiro进一步用PCR法证实了宫内感染的存在，采集了23例AIDS或血清阳性母亲的流产儿组织，进行PCR扩增，并作原位分子杂交比较，结果有7例用PCR检测到HIV-1DNA，而原位杂交只有1/8流产儿组织呈阳性反应.

　　由于HIV具有高度的变异性，使得AIDS的治疗显得颇为棘手，现已发现体外病毒分离株对AZT易感性降低.Richman利用一对寡核苷酸引物对接受AZT治疗者的外周血进行PCR扩增，得到的535bp的片段中含有与AZT耐药性有关的4个逆转录酶基因突变位点，而且突变数目与耐药程度成比例，因此，PCR能有效地监测毒株的耐药性.利用env基因的高度变异性，对该基因特异性扩增后进行病毒分型，对于监测毒株的变异及分子流行病学的研究具有十分积极的意义;对分娩健康婴儿的AIDS女患者HIV基因的扩增及分析，也有利于探讨母婴垂直传播的条件及毒株的特点，从而研制出有效的疫苗.

　　由此，我们可以看出，PCR技术在鉴定HIV感染方面具有重要的意义，它可检出抗体出现前的感染者，筛选新个体，确定病毒类型和耐药毒株，区分儿童感染的时间，并可作为AIDS的预后指征.

三、HIV感染的定量PCR研究

　　目前检测体内HIV活性的方法有限，虽然循环血CD4+细胞计数、血清P24抗原、新喋呤、β2-MG等曾用来指示HIV感染时病毒的水平，其敏感性和特异性均受限，定量培养又费时昂贵.定量PCR是HIV感染中直接测定病毒本身的最佳途径.早期首先采用有限稀释法，即将所采取的HIV感染者标本进行梯度稀释后分别进行PCR扩增，以反应阳性的最大稀释度

　　作为病毒水平，缺点是不能给出病毒的绝对拷贝数.后有作者用含有已知量的HIV序列的质粒DNA作为模板进行系列PCR反应，然后以扩增产物量对初始模板量得出标准曲线;待测标本用相同体系扩增后从标准曲线中求得所加标本量，从而推算出样品中HIV的感染水平.但在反应过程中既使严格控制实验条件和操作步骤，同一份标本在不同的试管内也存在着扩增的差异，即所谓的“试管效应”，因此，为了使PCR定量客观标准化，又引入了内参照来消除这种差异，如利用HLADQα基因与HIV感染标本用各自的引物在同一管中扩增，前者模板量已知，且作一系列梯度管，后者以一恒定的未知量参与反应，后用前者扩增的标准曲线来计算后者的初始模板水平，但缺点是这种内参模板的扩增效率与HIV的扩增效率不同.

　　从理论上讲，在PCR反应中应存在着这样一种关系，即Y=S(1＋e)n，Y指扩增后拷贝数，S是初始拷贝数，n代表循环次数，e指扩增效率.由于PCR对反应条件和初始模板量高度敏感，因此e值变异很大，可在0～1范围内波动，近年来在克服上述各种方法缺点的基础上而建立起来的竞争性定量PCR(QC-PCR)对HIV感染的定量分析已显示出广泛前景.其基本原理是人工设计与待测靶序列基本相同但能够区分的突变体(包括缺失、插入和限制性酶切位点突变)作为竞争模板，并以不同比例与一定量的靶序列共同混合于同一反应体系中，在相同引物介导下，两种模板共同扩增，当某一管中两种扩增产物的量相等时，该管中的已知竞争模板浓度即为靶序列的初始模板浓度.Piatak以HIV的高度保守区域gag基因作为靶序列，用含有HIV基因组的质粒为模板，设计引物用PCR方法合成一内部缺失80bp的gag片段，然后将此片段重组克隆后作为竞争模板.与待测标本共同扩增后的产物由于分子量大小不同，可用琼脂糖、聚丙酰胺凝胶电泳及密度扫描等计数结果，从而确定起始模板数.该方法在目前而言是一种相对客观而准确的定量途经，但其缺点是每测一份标本需设系列管，比较麻烦，造价昂贵，试剂盒难于推广.

　　最近美国AcuGen System研制了一种新的封闭式定量PCR系统，将生化、计算机和光电技术相结合，并采用专用试剂，从扩增的DNA直接做定量数据的读取和分析，免除了传统的电泳，照相等步骤，也排除标本污染的可能性.设备由三部分组成，定量读数器，扩增仪和计算机.其定量模式是根据能量转换原理设计.在PCR扩增到一定程度时，加入一信号试剂，即万能信号双链体，它是由互补的寡核苷酸链组成，该寡核苷酸链分别由具有荧光能量转换的供受者加尾修饰，连接在扩增引物的5'端，这种连接稳定了信号双链体，并建立了荧光能量转换反应，因为稳定结合在一起的双链体接受光后会发生能量转换.当以后的循环开始后，新生链开始产生，引起这种结合的引物双链体变为单链，接受光的能力下降，发生能量转换的全部瓦解.荧光信号随着循环次数的减少而被测量出来，以计算特定扩增片段的不断累积量.目前国内已有这种HIV检测试剂盒出售，但由于设备及试剂均很昂贵，限制了它的广泛应用.

　　对体内的病毒水平作准确的定量分析，有助于对感染过程的各期作病因性分析，观察药物的疗效，更好地指导治疗.Bagnarelli用QC-PCR法检测33例HIV感染者外周血标本中病毒的拷贝数及转录情况，结果提示，病毒拷贝数与疾病进展和CD4+淋巴细胞计数减少之间存在着与高度相关性，在疾病的各个阶段均存在着HIV-1结构基因的特异性转录和复制.有趣的是，尽管随着疾病的进展，病毒血症不断加重，但AIDS患者的个别感染细胞的转录活性仅中等度地高于无症状感染者.此外，血浆中HIV-1基因组RNA定量，似乎是更为可靠和敏感的病毒活性的标志.另有作者用定量PCR发现AIDS患者血浆中HIV-1数量明显高于无症状血清阳性者，在每8～14周口服ddT剂量≥6.4mg/Kg.天的患者，其血浆HIV-1颗粒数量明显降低，提示循环中游离病毒量与HIV-1的感染性滴度、CD4<400/mm3、HIV相关症状的存在和药物治疗密切相关，也说明PCR是监测这些指标的有效方法.

　　在HIV-1感染过程中，与免疫功能密切相关的细胞因子有无变化，是探讨其免疫致病机理的重要一环，由于细胞因子在血清中水平很低，仅达Pg水平;血清半衰期短，约数分到数小时，而且分泌后很快与受体结合，使得临床标本的检测成为困难.Fan利用PCR法分析了HIV-1感染者外周血细胞因子mRNA水平的变化，以β-actin作为内参照，对各种细胞因子mRNA水平定量，可精确至10个拷贝的mRNA.结果表明，血清阳性的男性同性恋者PBMC中IFN-γmRNA水平升高，而IL-2mRNA水平却下降，随着病情进展，这种变化更为明显;CD4和CD8细胞中这些细胞因子mRNA水平也不相同;所有细胞因子在HIV感染后期表达均下降.

四、PCR的相关问题

1.模板的选择和提取

　　艾滋病患者和HIV感染者的血液和各种体液中均含有一定量的病毒.目前作为诊断和研究的标本多采用外周血，因为HIV是一种嗜T细胞性病毒，其中模板量丰富且易保存，因此从PBMC较易得到HIVDNA，另外血浆中存在的游离病毒也可以作为提供模板的原料.HIV也常侵犯单核细胞、巨噬细胞、神经母细胞和皮肤的郎格罕氏细胞，所以也可采取除血液外的脑脊液和表皮组织提取模板来扩增，以探讨其致病机理.由于艾滋病多由性传播引起，因此唾液和精液也存在较低量的病毒颗粒，而且已用PCR发现虽然精液中存在HIV-1DNA，但精子细胞中却缺如，用PCR对这两种体液中病毒的检出对疾病的预防有重要意义.

　　传统PCR中模板的提取包括细胞裂解，酸氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀核酸等过程，步骤繁多.现在多数作者倾向采用粗制细胞裂解液或冰冻血液直接进行扩增.Albert将HIV感染者PMBC在含有SDS.tritonX-100和蛋白酶K的裂解液中处理后，直接将此混合物用于扩增，证明其非常适合于PCR过程.滤纸干血斑标本(DBS)的应用使标本采集更加简便，它采用指血，特别适合于围产期筛查和高危人群的分子流行病学大面积调查.Cassol测定了在模拟现场条件下保存DBS标本的稳定性和反应性，证实经过冻融、于22℃下保存22周或37℃和60%湿度下孵育7天的这种标本的DNA完整并适用于扩增分析，且低HIV拷贝数的DBS于上述条件下保存，PCR反应性也未降低.对AIDS患者和HIV感染者DBS标本的验证实验，均产生较强的PCR信号.

2.选择合适的引物，改良条件提高敏感性.

　　这一点在许多文献中均已报道主要原则为:1.减少设计引物的序列与HIV相关病毒或人细胞DNA的同源性;2，选择的引物要尽量处于HIV基因组的高度保守区，如gag、env、pol、tat基因中的某些核苷酸序列;3.尽量保证引物3'端的碱基与模板的匹配，引物内无一级结构和重复性，引物间和引物内不能有互补序列.常用的引物及位置见表1.

　　其次，PCR反应过程中多对引物的应用渐趋增多，由于HIV的高度变异，单纯一对引物的扩增结果已被认为不够确切，至少需要两对引物扩增才能鉴别阳性反应的存在.事实上，多对引物的应用可明显提高PCR的敏感性，Albert通过4对引物的应用，使100%的HIV感染者得到阳性扩增.套式引物PCR也能明显提高HIV感染检测的敏感性，并被用于AIDS患者病毒水平的定量研究中.Bagasra为使HIV感染的定量分析更加准确化，以细胞本身作为反应管，采用原位PCR，扩增完整细胞中的基因片段，发现外周血中感染的PBMC频率为0.1-13.5%，明显高于普通PCR;结合免疫磁珠分离技术，发现某些疾病进展者其CD4细胞比例增高，其HIV感染的CD4细胞水平也较高.

3.结果的检测

　　标本中模板得到有效的扩增后，必须客观地检测出来，一般多采用琼脂糖凝胶电泳后目测观察特异性扩增条带，必要时可采用聚丙酰胺凝胶电泳以提高分辨率.但有时这种方法达不到足够的敏感性，Keller报道了一种改良的探针检测法，引物与HIV-1gag基因互补，且5'端以生物素标记，扩增的产物既作为标本又作为探针;再设计一种“捕获”探针，其序列正好位于两引物之间，但不与引物重叠，这样避免了假阳性结果的出现.生物素化的PCR扩增产物在微量滴定板中被捕获，然后再与链霉亲和素一过氧化物酶结合物和四甲基联苯胺底物反应，用比色法测定，这种方法灵敏性和特异性大大提高.在QC-PCR中，为精确算出病毒拷贝数，将dNTP中的一种用放射性核素标记，经过30～50个循环后，PCR扩增产物即具有放射性.回收电泳胶带，分别测定二者的放射活性，根据不同浓度突变模板与标本的混合和扩增产物的放射性强度之间的关系，可以精确算出标本中DNA拷贝数.但由于使用同位素存在半衰期短，危险等缺点，虽可精确定量，却限制了PCR的实际应用，现也采用PCR-EIA(酶免疫法)来对HIV感染水平定量，来克服使用同位素的缺点.另外目前有些实验室中采用的电泳后EB染色凝胶的密度扫描也可借鉴.

PCR检测HIV中常用的引物和探针

区域	引物/探针	序列(5'-3')	HIV-1，HIV-2
LTR
sk29	Primer	ACTAGGGAACCCACTGCT	501-518
sk30	Primer	GGTCTGAGGGATCTCTA	589-605
SK31	Probe	ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT	552-585
SK89	Primer	AGGAGCTGGTGGGGAACG	9432-9449
SK90	Primer	GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA	9577-9596
SK91	Probe	TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG	9524-9561
GAG
SA38	Primer	ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT	1551-1578
SK39	Primer	TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC	1638-1665
SK19	Probe	ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC	1595-1635
SK145	Primer	AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT	1336-1395 ，1150-1121
SK101	Primer	GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC	1506-1482 ，1258-1234
SK150	Probe	TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC	1507-1480 ，1259-1232
SK102	Probe	GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT	1403-1435 ，1158-1190
SK100	Primer	ATCAAGCAGCCATGCAAAT	1377-1395 ，1132-1150
SK104	Primer	CCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC	1646-1667 ，1401-1422
SK109	Probe	AGATAGGATTGCAGAAGTGTGTCAGGATGTACAACCGACC	1351-1391
P1	Primer	TACATCAGGCCATATCACCTAC	764-768
P2	Primer	TGAAGGGTACTAGTACTTCCTGC	1041-1066
	Probe	AGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACC	993-1027
ENV
SK68	Primer	AGCAGCAGGAAGCACTATGG	7801-7820
SK69	Primer	CCAGACTGTGAGTTGCAACAG	7922-7942
SK70	Probe	ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT	7841-7875
SK122	Primer	CAAAGCCTAAAGCCATGTGTA	6569-6589
SK123	Primer	TAATGTATGGGAATTGGCTCAA	6870-6891
SK129	Probe	TGTAAAATTAACCCCACTCTGTGTTA	6586-6611
CO1	Primer	ACAATTATTGTCTGGTATAG	7855-7874
CO2	Primer	AGGTATCTTTCCACAGCCAG	7970-7989
CO3	Probe	TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG	7895-7934
POL
P3	Primer	TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCAC	2356-2381
P4	Primer	CCTACTATACAAATCATCCATGTATTC	2637-2663
	Probe	ATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCT	2508-2545
P5	Primer	ATTAGCAGGAAGATGGCC	4085-4103
P6	Primer	TACTCCTTGACTTTGGGG	4207-4225
	Probe	CCACCAACAGGCGGCCTTAACCGCAGCACTGGTGAAATT	4313-4171

　　总之，PCR 术在HIV 感染研究中的应用已获良好效果，在目前亚洲地区HIV 感染增长速率十分迅猛的情况下，开展此项技术的研究对于我国艾滋病的防治有着十分重要的现实意义.