微生物营养和环境条件实验

 

实验材料

1、活材料：培养3d的黑曲霉（Aspergillus niger）、根瘤菌（Rhizobium sp.）、培养24h的大肠杆菌（E. coli）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、培养5d的吸水链霉菌“5102”（Sterptomyces hygroscopicus “5102”）、培养24～48h的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的斜面菌种；其它自选的微生物材料，包括实验室已有的和自己从环境中分离得到的均可。

2、培养基：原则上可以参考以下培养基：完全培养基、缺C培养基、缺N培养基、缺P培养基、缺K培养基、缺Zn培养基、葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（含琼脂10g/L，每管12 mL）、牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基、牛肉膏蛋白胨培养液、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；也可以自己选定其它合适的培养基。

3、试剂： 0.2mol/L K2HPO4、0.2mol/L硼酸、0.2mol/L NaOH、0.1mol/L柠檬酸；1g/L HgCl2，200??g/L链霉素，200??g/L青霉素，50g/L石炭酸；或者其它合适的试剂。

实验用品

接种环、酒精灯、9 mL无菌水、1 mL无菌吸管、无菌水、无菌平皿、玻璃刮铲、灭菌五角星形图案纸（牛皮纸或黑纸）、紫外灯箱、无菌镊子、直径0.6cm的无菌圆形滤纸片；或其它实验用品。

实验设计方案的基本要求

本实验是在已经做了微生物的一些基本实验和综合实验的基础上进行的，实验设计方案中应简明地阐述实验目的、原理、材料、实验方法、观测结果以及结果分析等内容。

（一）拟订实验目的

实验目的应该写明：通过何种设计方案，采用哪种方法，说明哪些因素对微生物生长有影响，影响程度如何；从本次实验本人可以获得哪些收获等等。

（二）确定实验原理

对自己的实验设计方案、方法从理论上说明依据。如微生物生长需要哪些营养物质，包括有机物、矿质营养元素；微生物与氧气的关系；微生物的生长温度范围；微生物生长繁殖需要的酸碱度即pH值环境；紫外线对微生物的作用；化学药剂对微生物的生长抑制或杀死作用等等，应根据试验目的灵活选择。

（三）确定实验材料

实验材料应根据自己的实验目的来确定，可以是实验室已有的活菌种，也可以是自己从环境中分离得到的微生物材料。

（四）设计实验方法

实验方法的确定也应该根据实验目的进行。应该包括菌种的选择、配制何种培养基、需要哪些器材和药品、怎样接种、怎样培养、怎样观察结果等等。可供参考的实验方法如下：

1、营养元素对黑曲霉生长的影响

⑴制备培养基：本实验分组配制培养基，培养基配方见附录1-8。培养基分装试管，每管装量4～5mL，0.1MPa灭菌30min后备用。

⑵孢子悬液制备：取无菌水1支，用接种环从黑曲霉斜面菌种管中挑取菌体2～3环，放入水中，充分混匀，备用。

⑶接种：每人取完全、缺C、缺N、缺P、缺K和缺Zn培养液各一支，用1 mL无菌吸管按无菌操作法接种黑曲霉孢子悬液0.5 mL。本实验按每4人取一套培养基不接种作为对照。

⑷观察：接种后，将培养管置28℃温度下培养5～7d ,观察黑曲霉菌丝及孢子生长情况。★该试验用细菌类微生物作试验菌种能观察到明显的结果吗？为什么？

2、氧气对微生物生长的影响

⑴菌悬液制备：用接种环按无菌操作法取根瘤菌、巴斯德梭菌、大肠杆菌1～2环分别放入三支无菌水中制成菌悬液。

⑵接种：取已熔化并保温在50℃左右的培养基6支，用无菌吸管分别及取菌悬液0.2 mL接种到培养管中，每种试验菌接种2个重复，接种后立即置振荡器上混匀，并冷凝。

⑶培养：置培养管于28～30℃下培养3d。

⑷结果检查：取出培养管，观察并记录每支培养管的上、中、下各层次中细菌的菌苔大小，菌体集中分布的位置，以了解氧气对几种细菌生长的影响。

3、温度对微生物生长的影响

⑴接种：取牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基8支，用接种环按无菌操作法分别在斜面上划线接种大肠杆菌与枯草杆菌，勿划破培养基。

⑵培养：将已接种的斜面培养基，分别放在4℃、28℃、37℃和45℃四种温度下培养。

⑶观察：培养48h、72h后观察生长状况，根据菌苔的大小确定其生长最适温度。

4、氢离子浓度对微生物生长的影响

⑴培养基制备：分组按下列配方配制不同pH值的培养基，并用pH计校证pH值，然后分装入试管中，每管装量5～6 mL,0.1Mpa灭菌30min备用，见表。

⑵接种培养：取供试pH培养基三组用接种环按无菌操作法于试管中分别接入大肠杆菌、吸水链霉菌、黑曲霉。在37℃下培养48h。

⑶检查结果：出取培养物，观察并记录实验结果。

5、紫外线杀菌试验

⑴制平板：取无菌平皿6套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

 不同pH值培养基配制表

试管 序号	K2 HPO4 0.2mol/L(mL)	柠檬酸 0.1mol/L(mL)	NaOH 0.2mol/L(mL)	硼酸 0.2mol/L(mL)	牛肉膏蛋白胨 培养液（mL）	总量 （mL）	pH值 （近似值）
1 2 3 4 5 6 7 8 9	0.3 0.9 1.1 1.3 1.5 1.9 - - -	1.7 1.1 0.9 0.7 0.5 0.1 - - -	- - - - - - 0.3 0.7 1.0	- - - - - - 1.7 1.3 1.0	8 8 8 8 8 8 8 8 8	10 10 10 10 10 10 10 10 10	2.8 4.4 5.2 6.0 6.8 7.6 8.4 9.2 10.0

 

按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

⑵菌悬液制备：取试管无菌水2支，以无菌操作法分别取金黄色葡萄球菌和黏质沙雷氏菌各2环，接入无菌水中充分摇匀，制成菌悬液。

⑶接种：将已倒入培养基的平皿分成2组，每组3个，一组接金黄色葡萄球菌，一组接沙雷氏菌，用无菌吸管吸取已制好的菌悬液各0.1 mL，分别在接种于二组平板上，用无菌玻璃刮铲布均涂匀，随即用无菌镊子夹取无菌图案纸一张，小心放在接种好的平皿中央。

⑷分组：将接种的六个平皿分为三组，每组一个金黄色葡萄球菌，一个黏质沙雷氏菌。

⑸紫外线处理：将紫外灯先开灯预热2～3min。再将上述平皿置于紫外灯下，打开皿盖，在30cm距离处照射。一组照1min，1组照5min，1组照10min，小心地取下图案纸，盖上皿盖。用黑布或厚纸遮盖，送入培养室内。★此时能否不进行遮盖处理，直接拿出来培养？

⑹培养：将平皿于28～30℃温度下培养48h。

⑺观察：两菌在不同的处理条件下的生长状况，即有无生长、生长数量多少、生长的位置等。

6、化学药剂对微生物的作用

⑴制平板：取无菌平皿3套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

⑵制备菌悬液：取无菌水3支，用接种环分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌各1～2环接入无菌水中，充分混匀，制成菌悬液。

⑶接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1mL接种于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。注意做好标记。

⑷浸药：将灭菌滤纸片浸入供试药剂中。

⑸加药剂：用无菌镊子夹取浸药滤纸片，注意把药液沥干，分别平铺于同一含菌平

板上，注意药剂之间勿互相沾染并在平皿背面做好标记。

⑹培养：将平皿置于28℃下培养48～72h后观察结果。