高压电泳实验技术

相关专题

 

原理
同普通电泳。普通电泳的电压一般为2V/cm~20V/cm，电泳时间需1小时至数小时。电泳时间越长，扩散越严重。对于一些小分子 的物质如核苷酸、氨基酸、多肽等，在常压电泳中，往往达不到分离的目的。高压电泳则能使分子量相近的物质充分地进行分离。在高压电泳中，电压可达到50V/cm～200V/cm，高压电源达1 500V～1 0000V，电流可达50mA～400mA.电压越高，分离时间越短，所以在高压电泳中，一般只需较短的时间,数十分钟，有的甚至数分钟即可达到分离的目的。
高压电泳广泛地用于核苷、核苷酸 、氨基酸、多肽、糖、生物碱、有机酸等的分离。
高压电泳中最大的问题是冷却，常用的冷却方式有三种，即固体冷却、液体冷却和气体冷却。其中以液体冷却设备简单、效果也好。液体冷却剂的选择必须遵循以下几点：①与缓冲液互溶性小；②不溶解样品；易从纸上除去；不以爆炸；蒸汽不是剧毒性物质。一般常用的冷却剂有甲苯、四氯化碳、液体石蜡、氯苯、正己烷、乙庚烷等。以甲苯冷却效率最高。

材料与试剂
1．0.05mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液
2．5－AMP、ADP、ATP，每种核苷酸溶液的浓度为5mg/ml。
3．AMP－ADP－ATP混合液。取上述三种核苷酸溶液等体积混合而成。
4．点样管、毛细管
5．新华1号滤纸
6．玻璃喷雾器
7．高压电泳仪
8．聚乙烯膜等

操作方法
1．剪纸 剪适当大小滤纸，一般为60cm×10cm。
2．点样 点样的位置取决于样品的性质和缓冲液的pH，如不明确泳动方向，则点中线处。核苷酸在pH2～5均带负电荷，点靠负极一些。量为50μg～100μg，要求分离后每个斑点在5μg以上，否则在紫外灯下很难检查出来。点样时，样品越少越好，样品剂量较大时，可边点边用吹风机吹干，分数次点。注意勿伤纸面，不要把纸刮毛或弄皱。
3．电泳 以0.05Mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液，用玻璃喷雾器将滤纸喷湿，然后将喷湿的滤纸夹在二滤纸之间，以吸去多余的液体。将湿滤纸夹在两张聚乙烯膜之间，该膜使滤纸与冷却板绝缘，将此“夹层”夹在两块冷却板之间，旋紧冷却板的螺丝。在滤纸两头与电极槽缓冲液之间用数层滤纸搭桥，将电泳仪上的安全盖盖好，把冷却板上入水孔用橡皮管连上。将电表头电压调至4 000V，此时电流为28mA~30mA，相当于电势差66.6V/cm，电流2.8mA/cm~30mA/cm，通电20min，断电。迅速取出滤纸，吹干。

结果判定
用紫外灯（波长260nm）观察滤纸上的核苷酸分离情况。参照核苷酸的移动位置，可以确定结合物（样品）中有何种核苷酸。也可以根据实验条件，先确定各种标准核苷酸的迁移率作为分析的依据。