饱食和饥饿家兔肝糖原含量的比较
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【实验目的】
1. 掌握肝糖原提取的原理和方法。
2. 掌握定性比较饱食和饥饿家兔肝糖原含量的原理和方法。
【实验原理】
糖原是葡萄糖在机体内的重要储存形式之一。主要储存在肝细胞和肌细胞内,分别称为肝糖原和肌糖原,其中肝糖原储存量约占肝重的5%,肌糖原储存量约占肌重的2%~3%。肝糖原储存量虽不多,但在代谢过程中,它是机体内糖的重要来源之一。其合成或分解对血糖浓度的调节起着重要作用。许多因素可影响肝糖原的含量。如饱食后肝糖原增加,饥饿时肝糖原逐渐降低。
提取糖原是将新鲜的肝组织与石英沙及三氯醋酸共同研磨,当肝组织充分破碎后,其中的蛋白质被三氯醋酸所沉淀,而糖原仍留于溶液中。过滤除去杂蛋白。糖原不溶于乙醇,在上清液中加入乙醇溶液,糖原从溶液中沉淀析出。糖原是高分子 化合物 (分子量约400万),微溶于水,将离心后沉淀的糖原溶于水,溶液呈乳样光泽,即为糖原溶液。糖原无还原性,遇碘呈红棕色,经酸水解可生成还原性的葡萄糖。将糖原溶液的一部分作碘的颜色反应,另一部分经酸水解成葡萄糖后,用斑氏(Benedict)试剂检验。利用上述性质,进行饱食与饥饿家兔肝糖原的比较。
【器材和试剂】
1. 器材 匀浆机、离心机 、台秤、试管及试管架、烧杯、水浴锅、白瓷板。
2. 试剂
(1)5%三氯醋酸溶液。
(2)0.3%碘液。
(3)95%乙醇。
(4)20%NaOH溶液。
(5)浓盐酸溶液。
(6)班氏定性试剂。
【操作步骤】
1. 在匀浆机中加入适量5%三氯醋酸溶液。
2. 将家兔(饥饿和饱食)快速杀死,剖腹取出肝脏,迅速以滤纸吸去附着的血液后,将饥饿和饱食家兔肝脏分别放入匀浆机制备肝匀浆(因为肝脏离体后,肝糖原会迅速分解。因此在杀死动物后,所得肝脏必须迅速以三氯醋酸处理以防分解)。
3. 沉淀,过滤,弃去杂蛋白,滤液分别收集于烧杯中备用,观察并比较两种溶液浑浊程度。
4. 分别于饥饿和饱食家兔肝匀浆滤液中取滤液4ml,加入等体积95%乙醇,充分混匀后,离心3min(3000r/min),比较两管糖原沉淀量。
5. 小心倾去上清液,于每管各加入蒸馏水5ml,加温,至沉淀溶解,即为糖原溶液。
6. 取试管3支,编号,按下表操作:
试管号
1
2
3
饱食鼠肝糖原溶液
2ml
—
—
饥饿鼠肝糖原溶液
—
2ml
—
蒸馏水
—
—
2ml
0.3%碘液
2滴
2滴
2滴
混匀,观察并记录颜色,进行比较。
7. 取试管2支,各加入饥饿家兔或饱食家兔肝糖原溶液2ml,每管加入浓盐酸10滴,置沸水浴中水解约10min,取出冷却,然后用20%NaOH中和(约20滴),此即为肝糖原水解液。
8. 取试管3支,编号,按下表操作:
试管号
1
2
3
班氏试剂
1ml
1ml
1ml
饱食家兔肝糖原水解液
5滴
—
—
饥饿家兔肝糖原水解液
—
5滴
—
蒸馏水
—
—
5滴
混匀,置沸水浴中3min,观察记录颜色及沉淀量。
【思考题】
1.在杀死实验动物后,离体肝脏为什么要迅速用三氯醋酸处理?
2.在提取肝糖原实验中,使糖原从溶液中沉淀析出应添加什么试剂?