实验室一些常用知识介绍
互联网
- 相关专题
一.玻璃仪器的洗涤及一些常用的洗涤剂
1. 玻璃仪器的洗涤
(1)新购买的玻璃仪器, 首先用自来水洗去表面灰垢, 然后用洗衣粉刷洗, 自来水冲净后, 浸泡在 1%~2% 盐酸溶液中过夜以除去玻璃表面的碱性物质。最后, 用自来水冲洗干净, 并用蒸馏水冲洗 2 次。
(2)对于使用过的玻璃仪器, 应先用自来水冲洗, 再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自来水充分冲洗后再用蒸馏水冲洗 2 次。凡洗净的玻璃仪器壁上都不应带有水珠, 否则表示尚未洗净, 需重新洗涤。
(3)比较脏的仪器或不便刷洗的仪器, 使用前应用流水冲洗, 以除去粘附物, 如果仪器上有凡士林或其他油污, 应先用软纸擦除, 再用有机溶剂擦净，最后用自来水冲洗。待仪器晾干后, 放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出后用自来水充分冲洗, 再用蒸馏水冲洗 2 次。
(4)普通玻璃仪器可在烘箱内烘干, 但定量的玻璃仪器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等不能加热, 应晾干备用。另外, 分光光度计 中的比色杯的四壁是用特殊胶水粘合而成, 受热后会散架, 所以也不能烘干。
对疑有传染性的样品 ( 如肝炎病人的血清 ), 其容器应先消毒再清洗。盛过剧毒药物或放射性同位素物质的容器, 应先经过专门处理后再清洗。
2. 一些常用的洗涤剂
a. 肥皂水或洗衣粉溶液
这是最常用的洗涤剂, 主要是利用其乳化作用以除去污垢, 一般玻璃仪器均可用其刷洗。
b. 铬酸洗液 ( 重铬酸钾一硫酸洗液 )
铬酸洗液广泛用于玻璃仪器的洗涤, 其清洁效力来自于它的强氧化性 (6 价铬) 和强酸性。铬酸洗液具有强腐蚀性, 使用时应注意安全。铬酸洗液可反复使用多次, 如洗液由红棕色变为绿色或过于稀释则不宜再用。
c. 5%~10% 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA -Na2) 溶液: 加热煮沸, 利用 ED-TA 和金属离子的强配位效应, 可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易 溶解的重金属盐类。
d. 45% 的尿素洗液: 是蛋白质的良好溶剂, 适用于洗涤盛蛋白质制剂血样的容器。
e.乙醇一硝酸混合液
用于清洗一般方法难于洗净的有机物, 最适合于洗涤滴定管。
二.生物化学常用缓冲液
1. 磷酸盐缓冲液
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2 个pka 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽：
NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21
Na2HP04：pKa1=7.21, pKa2=12.32
配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 1~4 。
配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 6~8。
配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 10~12 。
磷酸盐缓冲液的优点为：
① 容易配制成各种浓度的缓冲液;
② 适用的 pH 范围宽;
③ pH 受温度的影响小;
④ 缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。
其缺点为：
①易与常见的Ca2+、 Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀;
②会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。
2.Tris缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷)
Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳 中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。
Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在 " 中性 " 范围 , 例如
Tris-HCl 缓冲液pH 值为 7.5~8.5
Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.0~9.0
Tris-HCl 缓冲液的优点是：
① 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性的大范围 pH 值的缓冲液;
② 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。
其缺点是：
①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释 10 倍 , pH 值的变化大于 0.1;
②温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4℃时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 ℃时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0~4℃;
③易吸收空气中的 C02, 所以配制的缓冲液要盖严密封;
④此缓冲液对某些 pH 电极发生一定的干扰作用, 所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电极。
3. 硼酸盐缓冲液
常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.5~10.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类的短基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。
4. 氨基酸缓冲液
此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.0~11.0, 例如最常用的有：
甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.0~5.0 。
甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0 。
甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0( 此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液 ) 。
组氨酸缓冲液：pH 值为 5.5~6.5 。
甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.8~8.8 。
甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 〉缓冲液：pH 值为 8.0~9.0 。
此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。
其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过程等; ②试剂的价格较高。
三.pH 值的测定
测定溶液 pH 值通常有两种方法, 最简便但较粗略的方法是用 pH 试纸, 分为广泛和精密 pH 试纸两种。
精确测定溶液 pH 值要使用 pH 计, 其精确度可达 0.005 个 pH 单位, 关键是要正确 选用和校对 pH 电极。过去是使用两个电极, 即玻璃电极和参比电极, 现在它们已淘汰, 被两种电极合一的复合电极所代替。
玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感, 其头部为一薄玻璃泡, 内装有 0.lmol/L HCl, 上部由银 -氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时, 薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的 pH 值, 即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度 ( 活 度 ) 的变化而变化。
参比电极的功能是提供一个恒定的电位, 作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极 (Hg/HgCl) 或银 -氯化银电极 (Ag/AgCl) 。参比电极电位是氯离子浓度的函数, 因而电极内充以 4mol/L KCl 或饱和 KC1, 以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和 KCl 是为使电极内沉积有部分 KCl 结晶, 以使 KCl 的饱和浓度不受温度和湿度的影响。
现在 pH 值测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极, 即将它们共同组装在一根玻璃管使用时应注意：
(1) 经常检查电极内的 4mol/L KCl 溶液的液面, 如液面过低则应补充 4mol/L KCl溶液。
(2) 玻璃泡极易破碎, 使用时必须极为小心。
(3) 复合电极长期不用, 可浸泡在 2mol/L KCl 溶液中, 平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液中, 使用时取出, 用洗并冲洗玻璃泡部分, 然后用吸水纸吸干余水, 将电极浸入待测溶液中 , 稍加搅拌, 读数时电极应静止不动, 以免数字跳动不稳定。
(4) 使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。
(5) 使用前要用标准缓冲液校正电极, 其数据见书后附录, 常用的 3 种标准缓冲液pH 值 4.00 、 6.88 和 9.23(20 ℃ ), 精度为± 0.002pH 单位。校正时先将电极放入 6.88 的标准缓冲液中, 用 pH 计上的 " 标准 " 旋钮校正 pH 读数, 然后取出电极洗净, 再放入 pH 值为 4.00 或 9.23 的标准缓冲液中, 用 " 斜率 " 旋钮校正 pH 读数, 如此反复多次, 直至二 点校正正确, 再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。
(6) 电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的 pH 值时, 玻璃泡表面会覆 盖一层蛋白质膜, 不易洗净而干扰测定, 此时可用 0.1mol/L HCl 的 lInurnl 胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染, 可用丙酣浸泡。若电极保存时间过长, 校正数值不准时, 可将电极放入 2mol/L KCl 溶液中 ,40 ℃加热 lh 以上, 进行电极活化。
pH 测定时会有几方面的误差：
(1) 钠离子的干扰： 多数复合电极对 Na+ 和 H+ 都非常敏感, 尤其是高 pH 值的碱性溶液 ,Na的干扰更加明显。例如 , 当 Na+ 浓度为 0.1mol/L 时, 可使 pH 值偏低 0.4~ 0.5 个单位。为减少 Na+ 对 pH 测定的干扰, 每个复合电极都应附有一条校正Na+ 干扰的标准曲线, 有的新式的复合电极具有 Na+ 不透过性能, 如不具备以上两个条件, 则可以将电极内的 KCl 换成NaCl。
(2 〉浓度效应：溶液的 pH 值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关, 因为溶 液 pH 值取决于溶液中的离子活度而不是浓度, 只有在很稀的溶液中, 离子的活度才与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高 10 倍的 " 贮液 ", 使用时再稀释到所需浓度，由于浓度变化很大，溶液pH会有变化，因此稀释后仍需对其pH进行调整。
(3)温度效应：有的缓冲液的pH受温度影响很大，如Tris 缓冲液，因此配制和使用都要在同一温度下进行。
