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枯草杆菌蛋白酶活力的测定原理与实验步骤

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一、实验目的

1.加深了解酶活力的概念。

2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理

酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后,反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。

实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收,其吸光值与酪氨酸含量呈正比。

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化,可计算出蛋白酶的活力。

三、仪器和试剂

仪器:

恒温水浴锅、分光光度计 、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

原料

枯草杆菌蛋白酶:称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉,用少量0.02mol/L,pH7.5磷酸缓冲液 溶解并定容至100mL,震荡15分钟,使充分溶解,干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。

试剂

1. Folin-酚试剂:

在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g,钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL,充分混匀后,微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g,蒸馏水50mL 和液溴数滴,摇匀后开口继续煮沸15min,以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL,过滤,溶液呈黄绿色,置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L),然后加水稀释至1mol/L,即可使用。

2. 0.2mol/L 盐酸溶液

3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液

4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液

5. 10%三氯乙酸溶液

6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液:

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g,用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g,用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL,B 液16mL 混合后,得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液,可长期存放。临用时稀释10倍即可。

7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL):称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸,用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后,蒸馏水定容至250mL。

8. 酪蛋白溶液(0.5%):称取1.25g 酪蛋白,用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解,再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。

四、操作步骤

(一)酪氨酸标准曲线的制作

取6支试管(标号0,1~5),按顺序分别加入0.00,0.20,0.40,0.60,0.80和1.00mL 标准酪氨酸溶液,再用水补足到1.00mL,摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL,摇匀。依次加入Folin—酚试剂1.00mL,摇匀并计时,于30℃水浴锅中保温15min。然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(二)酶活力测定

1.酶反应:取一支试管,加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液,于30℃水浴中预热5分钟,再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液,立即计时,水浴中准确保温10min,从水浴中取出后,立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液,摇匀静置数分钟,干滤纸过滤,收集滤液(样品液)。另取一试管,先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液,摇匀,放置数分钟,再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液,然后于30℃水浴保温10min,同样干滤纸过滤,收集滤液(对照液)。

以上两过程,应各做一次平行实验。

2.滤液中酪氨酸含量的测定

取3支试管,分别加入1.0mL 水、A 液、B 液,然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂,摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值,由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值,即可推算出酶的活力单位。

五、计算

<center> </center>

A 样品—样品液的吸光度值

A 对照—对照液的吸光度值

K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸&mu;g 数

V—酶促反应液的体积(本实验为5mL)

T—酶促反应时间(本实验为10min)

N—酶溶液稀释倍数

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