薄层层析溶剂/展开剂/显色剂的选择配制及注意事项

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薄层层析（TLC）技术

薄层色谱方法总结
1.方法原理
(1)流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。
(2) 样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 - (诱导) - 偶极相互作用，
氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。
2.溶剂
使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”，溶剂组成采用体积量比(如正丁醇 - 冰乙酸 - 水= 4：1：1，V/V/V)，或者绝对量(如18ml 甲苯 + 2 ml 甲醇)。其总量应足以使TLC /HPTLC 板的浸入深度约为5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层，则按要求放置分层后取需要的一相(上层或下层)，备用。
一、溶剂选择规则：
1、 考虑分离成分的极性、溶解度、吸附度。
2、 先加入极性较小的溶剂，若不容再加入少量极性大的溶剂
3、 一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶。
4、 混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂。
5、 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。
6、 一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例(或者加入第三种溶剂),达到最佳效果;如果没有分开的迹象(斑点较“拖”)，最好是换溶剂。
二、展开剂的选择条件：
① 对的所需成分有良好的溶解性; ②可使成分间分开;
② 待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间;
③ 不与待测组分或吸附剂发生化学反应; ⑤沸点适中，黏度较小;
⑥展开后组分斑点圆且集中; ⑦混合溶剂最好用新鲜配制。
三、溶剂极性参数表
环已烷 :-0.2、石油醚(Ⅰ类，30~60℃)、石油醚(Ⅱ类，60~90℃)、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2
1、一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离;
2、中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离;
3、强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。
四、展开剂的选择
物质分子 化学结构中，通常由较极性部分和非极性部分两部分。例如下面以苯丙烷为极性小部分，随着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加了。
以下分开讨论不同化合物极性情况及其对应的展开剂。
1、类极性较小的挥发性物质
冰片：石油醚(30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、 厚朴酚：苯-醋酸乙酯(9:1.5)、
α-香附酮：苯-醋酯乙酯-冰醋酸(92:5:5)、 丹皮酚：环己烷-醋酸乙酯(3:1)，
结论：以石油醚、正构烷和苯为体积百分数比较大的溶剂，通常起溶解和分离化合物的作用，而用醋酸乙酯为调节Rf(比移值)的溶剂。为了减少拖尾之类其他相似相溶原则以外的影响，适当加入添加剂，如有机酸或者有机碱。
2、类极性较小的不挥发性物质
β -谷甾醇：环己烷-醋酸乙酯-甲醇(6:2.5:1)或者环己烷-丙酮(5:2)、
熊果酸：甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12:4:0.5)、 齐墩果酸：氯仿-甲醇(40:1)、
猪去氧胆酸：氯仿-乙醚-冰醋酸(2:2:1)、
大黄素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇(8:1)、
丹参酮ⅡA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、 穿心莲内酯：氯仿-无水乙醇(9:1)
靛玉红、靛蓝氯仿-乙醇(9:1)或者苯-氯仿-丙酮(5:4:1)
结论：这类物质展开剂极性比极性较小的挥发性物质洗脱力强一些，因为这类物质极性小的母核大，而极性大的基团通常可以形成氢键，比如羧酸、羟基。以上物质，母核分子量减小、母核结构中不饱和健的增加(尤其是出现苯环)，极性基团的增加，都使极性增加，展开剂极性也增大。。这个范围内的物质很多，一般展开剂大百分数的溶剂可以从环己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的顺序，按照极性要求选择。这里注意，异丙醇、正丁醇极性指数也比较小，在这范围的化合物很少用，因为粘性大、展开慢，造成斑点扩散;另外，羟基的氢键作用力也有不利。调节Rf值的溶剂，从醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。挥发性物质也有很多带羰基、羟基的，但从它的挥发性就可以明白，分子间作用力不强，另外，母核与石油醚、正构烷和苯的结构差异小，估计更容易脱离硅胶吸附，更快进入溶剂中，而不需要通过提高展开剂的极性。
由于存在糖的多羟基结构，苷元的结构影响变小。展开剂中使用极性大的有机溶剂(氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇)和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展开剂极性，另外也可以抑制硅胶羟基的作用，减少拖尾。由于混溶性和硅胶耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。
3、类极性大的小分子 有机酸：
没食子酸：氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、异绿原酸。例如下面以苯丙烷为极性小部分，随着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加了。依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。相应展开剂分别为：正己烷—乙醚—冰醋酸(5:5:0.1)、苯-冰醋酸-甲醇(30:1:3)、氯仿-甲醇-甲酸(9:1: 0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3:6: 1)、醋酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)。
结论：
这类物质多数是苯乙烯母核的，这个结构的极性本身比较大，另外有酚羟基和羧酸基团，个别有多羟基配基。皂苷的展开剂差不多，极性大。注意甲酸通常指的是浓度85%左右的，含有水。
4、类含氮有机物：
盐酸小檗碱：苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸气饱和)或正丁醇-冰醋酸-水(7:1:2)、
麻黄碱：氯仿-甲醇-浓氨试液(20:5:0.5)或正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1)
甘草酸铵：醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)。
结论分析：由于NH2硅醇基的作用很强，在强极性展开剂加有机酸、有机碱扫尾。对于极性化合物，使用正丁醇对斑点扩散影响较小，因为化合物和硅胶的作用强。
当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂(如以硅藻土或滑石粉代替硅胶)，则洗脱剂的极性亦须相应降低。
3.TLC的通用显色方法
理想的显色希望灵敏度高，斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好，斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比，在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得尤为重要，通用显色方法主要有：
E/m T2K gV"p Fg4244131、紫外照射法：方便、不破坏样品;
Pl o;E r"m‑z s? d T$V4244132、碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用;
$b8M"}?(P [+e4244133、荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显;小木虫学术博客 J­M0D6{Rf;r
4、硫酸溶剂：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。
4.薄层层析和纸色谱操作注意事项
1、点样 点样器点样于薄层板上,一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样点直径一般不大于2mm,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。点样时必须注意勿损伤薄层表面
2、展开 将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密封，待展开至规定距离(一般为8～15cm)，取出薄层板，晾干，待检测。
注：展开缸如需预先用展开剂预平衡，可在缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15-30分钟。
3、显色与检视 供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在356nm紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板(如GF254板)，在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。
把我的祖传秘方告诉你吧
PE(60-90)EtAc/PE=1:2 EtAc/PE/AcOH=15:5:1 EtAc/AcOH/n-Butanol/H2O=2:1:1:1
8年来我用这四种体系,没有出现过什么问题.我一直在用的是乙酸乙酯：环已烷，不断调节比例，直到有满意的Rf值，有拖尾时可能要加酸或碱，我一般乙酸和三乙胺。
我用了好几年了，都还好。不妨一试!
铺板
铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载;涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。
点样
尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。
展开剂配制
选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。展开系统的饱和一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。
温湿度的控制
温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性(容量因子)的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。
显色
喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。

solvent	polarity	Viscosity(cp20℃)	Boiling point(℃)	UV cutoff(nm)
i-pentane(戊烷)	0.00	--	30	--
n-pentane	0.00	0.23	36	210
Petroleum ether(石油醚)	0.01	0.30	30-60	210
Hexane(己烷)	0.06	0.33	69	210
Cyclohexane(环己烷)	0.10	1.00	81	210
Isooctane(异辛烷)	0.10	0.53	99	210
Trifluoroacetic acid(三氟乙酸)	0.10	--	72	--
Trimethylpentane(三甲基戊烷)	0.10	0.47	99	215
Cyclopentane(环戊烷)	0.20	0.47	49	210
n-heptane(庚烷)	0.20	0.41	98	200
Butyl chloride(丁基氯; 丁酰氯)	1.00	0.46	78	220
Trichloroethylene(三氯乙烯; 乙炔化三氯)	1.00	0.57	87	273
Carbon tetrachloride(四氯化碳)	1.60	0.97	77	265
Trichlorotrifluoroethane(三氯三氟代乙烷)	1.90	0.71	48	231
i-propyl ether(丙基醚; 丙醚)	2.40	0.37	68	220
Toluene(甲苯)	2.40	0.59	111	285
p-xylene(对二甲苯)	2.50	0.65	138	290
Chlorobenzene(氯苯)	2.70	0.80	132	--
o-dichlorobenzene(领二氯苯)	2.70	1.33	180	295
Ethyl ether(二乙醚; 醚)	2.90	0.23	35	220
Benzene(苯)	3.00	0.65	80	280
Isobutyl alcohol(异丁醇)	3.00	4.70	108	220
Methylene chloride(二氯甲烷)	3.40	0.44	40	245
Ethylene dichloride(二氯化乙烯)	3.50	0.79	84	228
n-butanol(丁醇)	3.90	2.95	117	210
n-butyl acetate(醋酸丁酯; 乙酸丁酯)	4.00	---	126	254
n-propanol(丙醇)	4.00	2.27	98	210
Methyl isobutyl ketone()	4.20	--	119	330
Tetrahydrofuran( 四氢呋喃)	4.20	0.55	66	220
ethanol	4.30	1.20	79	210
Ethyl acetate	4.30	0.45	77	260
i-propanol(丙醇)	4.30	2.37	82	210
Chloroform(氯仿)	4.40	0.57	61	245
Methyl ethyl ketone(甲基乙基酮)	4.50	0.43	80	330
Dioxane(二恶烷; 二氧六环; 二氧杂环己烷)	4.80	1.54	102	220
Pyridine(吡啶)	5.30	0.97	115	305
Acetone(丙酮)	5.40	0.32	57	330
Nitromethane(硝基甲烷)	6.00	0.67	101	380
Acetic acid(乙酸)	6.20	1.28	118	230
Acetonitrile(乙腈)	6.20	0.37	82	210
Aniline(苯胺)	6.30	4.40	184	--
Dimethyl formamide(二甲基甲酰胺)	6.40	0.92	153	270
Methanol()	6.60	0.60	65	210
Ethylene glycol(乙二醇)	6.90	19.90	197	210
Dimethyl sulfoxide()	7.20	2.24	189	268
water	10.20	1.00	100	268

常用溶剂参数表

化合物名称 中文名称	极性	粘度	沸点	吸收波长
i-pentane (异戊烷)	0	-	30	-
n-pentane (正戊烷)	0	0.23	36	210
Petroleum ether (石油醚)	0.01	0.3	30～60	210
Hexane (己烷)	0.06	0.33	69	210
Cyclohexane (环己烷)	0.1	1.0	81	210
Isooctane (异辛烷)	0.1	0.53	99	210
Trifluoroacetic acid (三氟乙酸)	0.1	-	72	-
Trimethylpentane (三甲基戊烷)	0.1	0.47	99	215
Cyclopentane (环戊烷)	0.2	0.47	49	210
n-heptane (庚烷)	0.2	0.41	98	200
Butyl chloride (丁基氯; 丁酰氯)	1.0	0.46	78	220
Trichloroethylene (三氯乙烯; 乙炔化三氯)	1.0	0.57	87	273
Carbon tetrachloride (四氯化碳)	1.6	0.97	77	265
Trichlorotrifluoroethane(三氯三氟代乙烷)	1.9	0.71	48	231
i-propyl ether (丙基醚; 丙醚)	2.4	0.37	68	220
Toluene (甲苯)	2.4	0.59	111	285
p-xylene (对二甲苯)	2.5	0.65	138	290
Chlorobenzene (氯苯)	2.7	0.8	132	-
o-dichlorobenzene (邻二氯苯)	2.7	1.33	180	295
Ethyl ether (二乙醚; 醚)	2.9	0.23	35	220
Benzene (苯)	3.0	0.65	80	280
Isobutyl alcohol (异丁醇)	3.0	4.7	108	220
Methylene chloride (二氯甲烷)	3.4	0.44	240	245
Ethylene dichloride (二氯化乙烯)	3.5	0.78	84	228
n-butanol (正丁醇)	3.7	2.95	117	210
n-butyl acetate (醋酸丁酯；乙酸丁酯)	4.0	-	126	254
n-propanol (丙醇)	4.0	2.27	98	210
化合物名称 中文名称	极性	粘度	沸点	吸收波长
Methyl isobutyl ketone (甲基异丁酮)	4.2	-	119	330
Tetrahydrofuran (四氢呋喃)	4.2	0.55	66	220
Ethanol (乙醇)	4.3	1.20	79	210
Ethyl acetate （乙酸乙酯）	4.3	0.45	77	260
i-propanol (异丙醇)	4.3	2.37	82	210
Chloroform (氯仿)	4.4	0.57	61	245
Methyl ethyl ketone (甲基乙基酮)	4.5	0.43	80	330
Dioxane (二恶烷; 二氧六环; 二氧杂环己烷)	4.8	1.54	102	220
Pyridine (吡啶)	5.3	0.97	115	305
Acetone (丙酮)	5.4	0.32	57	330
Nitromethane (硝基甲烷)	6.0	0.67	101	330
Acetic acid (乙酸)	6.2	1.28	118	230
Acetonitrile (乙腈)	6.2	0.37	82	210
Aniline (苯胺)	6.3	4.40	184	-
Dimethyl formamide (二甲基甲酰胺)	6.4	0.92	153	270
Methanol (甲醇)	6.6	0.60	65	210
Ethylene glycol (乙二醇 )	6.9	19.9	197	210
Dimethyl sulfoxide (二甲亚砜 DMSO)	7.2	2.24	189	268
Water （水）	10.2	1.0	100	268

常用混合溶剂极性顺序：
环己烷:乙酸乙酯(8:2) < 氯仿:丙酮(95:5) < 苯:丙酮(9:1) <苯:乙酸乙酯(8:2) < 氯仿:乙醚(9:1) < 苯:甲醇(95:5) < 苯:乙醚(6:4) < 环己烷:乙酸乙酯(1:1) < 氯仿:乙醚(8:2) < 氯仿:甲醇(99:1) < 苯:甲醇(9:1) < 氯仿:丙酮(85:15)< 苯:乙醚(4:6) < 苯: 乙酸乙酯(1:1) < 氯仿:甲醇(95:5) < 氯仿:丙酮(7:3) < 苯: 乙酸乙酯(3:7) < 苯:乙醚(1:9) < 乙醚:甲醇(99:1) < 乙酸乙酯:甲醇(99:1) < 苯:丙酮(1:1) < 氯仿:甲醇(9:1)