利用SPA-sepharose cl-4b 亲合层析法分离纯化IgG抗体

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免疫球蛋白 分离的方法很多，IgG分离纯化时多采用离子交换法，本文就采用SPA-sepharose cl-4b 亲合层析法分离纯化IgG的原理、试剂、操作步骤以及注意事项进行了总结。

一、原理

葡萄球菌a蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物 IgG分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-sepHarose cl-4b 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

二、试剂器材

1、spa-sepharose cl-4b (pharmacia-sigma)

2、磷酸缓冲液 0.1mol/l pH8.6+0.02% NaN3

3、枸橼酸缓冲液

0.1mol/l pH5.5 0.1mol/l pH4.0

0.1mol/l pH3.0 分别+0.02% NaN3

4、1mol/l pH9.0 tris-HCl溶液

5、再生缓冲液

(1)0.1mol/l tris含0.5mol/l NaCl调整pH至8.6+0.02% NaN3;

(2)0.1mol/l 醋酸钠含0.5mol/l NaCl调整pH至2.2+0.02%NaN3。

三、操作步骤

1.用0.1mol/l pH8.6磷酸缓冲液浸泡SPAF-sepharose cl-4b凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。

2.装柱后用0.1mol/l pH8.6磷酸缓冲液平衡。

3.标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/l pH9.0 tris-HCl 液调整标本液pH至8.6或对平衡液透析过夜。

4.加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/l pH8.6磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。

5.用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH5.5;纯IgG2a用pH4.0 ;纯化IgG2b用pH3.0

6.用(2)再生缓冲液洗脱剩余蛋白，洗脱后用(1)再生缓冲液平衡完成再生

7.收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

四、注意事项

1、PA-sepharose cl-4b凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。

先用10倍柱体积0.1mol/l pH8.6 tris含0.5mol/l NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/l pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/l NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/l pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

2、SPA-sepharose cl-4b亲合层析法还可用于

(1)除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性

(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段

(3)吸收或纯化免疫复合物

3、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgM和IgA也具有与SPA结合的能力。

使用PA-sepharose cl-4b分离纯化IgG主要有以下三个优点：一、操作简单，可进行大规模操作；二、纯化产率高、特异性强；三、使用范围广，可以纯化IgG，也可以用于纯化IgM，但是主要的缺点就价格比较贵。