Double

相关专题

 

Protein表达是一个非常复杂的过程，因此很难预测表达的蛋白是否是可溶性的、包涵体形式还是部分降解的。为了预防各种可能的困难条件，在重组蛋白上导入两种Tag可以提供获得高纯度均质蛋白的灵活性。

蛋白含有两种不同亲和纯化Tag的重要原因：
纯化全长的蛋白
获得最高纯化的蛋白
适合变性或生理条件下纯化
优化的操作过程，可以直接从培养基中纯化蛋白

与Strep-tag®配合最有效的是6xHistidine-tag，总之推荐一个Tag在蛋白的N-端，另外一个Tag在蛋白的C-端。

纯化全长蛋白：

重组的蛋白在表达时会有部分降解，即使在下游的处理过程中加入蛋白酶抑制剂也无法避免。可溶性降解蛋白仍然带有纯化tag，在纯化时会引起纯化蛋白的不纯（由于有不同长度片段的蛋白混入）。这种问题可以通过在蛋白的另一端加入第二种Tag来解决。经过第二种Tag的纯化，即可获得全长的蛋白。

最高纯度的蛋白：

在生理条件下，Strep-tag纯化可以将重组蛋白的纯化提升到约99％。由于重组蛋白特性不同，纯化的高低也有差异。尽管可以通过更改纯化树脂来解决该问题，但是采用第二种纯化Tag是目前最有限的方法。尤其对于结晶学研究、免疫 和高通量分析，高纯度蛋白的获得非常重要。

适合变性或生理条件下纯化：

很难预测表达的重组蛋白是可溶性还是形成包涵体，这由启动子的强度和蛋白自身的折叠速率所决定。如果蛋白是可溶性的并具有生理功能，Strep-tag是纯化的最佳选择，因为其可以在生理条件下纯化蛋白从而保持蛋白的生物学活性。如果蛋白以包涵体形式存在，需要加入高浓度的胍盐或尿素使之变性成为可溶以便亲和纯化。在此变性条件下，可以借用6xHistidine-tag的金属鳌合活性分离蛋白。采用Ni-NTA 柱，蛋白还可以重新折叠。如果由必要，可借用Strep-tag在生理条件下纯化重新折叠的蛋白。

直接从培养基中纯化蛋白：

对于高表达的载体(如：昆虫细胞)，重组蛋白分别到培养基中是经常采用的表达策略。在此情况下，推荐先采用6xHistidine-tag进行第一步的收集。由于6xHistidine-tag对Ni-NTA
matrix具有极高的亲和能力，通过分批纯化，重组蛋白可以高效收集。作为阳性负对照，生物素与Strep-tag纯化系统不兼容，其通常存在于培养基中，经过6xHistidine-tag的收集，生物素可以除去。如果由必要，可以采用Strep-tag作为第二步纯化以获得更高纯度的蛋白。