LORRY法蛋白定量的实验步骤和需知事项

相关专题

 

蛋白定量 的方法主要有以下三种：BCA法、考马斯亮蓝法和Lorry法。其中LORRY法蛋白定量也就是利用菲林-酚试剂法对蛋白质含量进行测定的实验方法。本文主要对其实验步骤进行介绍。

[原 理]

斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。

(一)材料

各种植物 材料。

(二)仪器设备

722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。

(三)试剂

(1)0.5mol/L Na0H。

(2)斐林—酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：

A液：4%碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液：1%硫酸铜(CuS04•5H20)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林—酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04•2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4.H2O)150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色(若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min)。待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。因此在使用前应进行标定。标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L的酸度。

在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH≠10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

⑷标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使终浓度为250μg/ml。

[实验步骤]

(一)标准曲线的绘制

(1)取18mm×200mm试管7支，1-7编号，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1mL，使每管含蛋白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L。

(2)用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液，混匀，于30℃下放置10min。

(3)再向试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在30℃下准确保温30min

(4)以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(二)样品的测定

样品的提取：称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000 r/min离心10min，取上清液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2～4步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

[结果计算]

样品中蛋白的含量==C×VT/(Vs×FW×1000)

式中：C为查标准曲线值，μg;VT为提取液总体积，mL;WF为样品鲜重，g;Vs为测定时加样量，mL。

注意事项

还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。

LORRY法蛋白定量是蛋白测定中最灵敏、应用范围最广的方法之一，适于5～l00μg蛋白质的定量，在实验中要特别注意排除还原物质、柠檬酸等的干扰作用才能得到最准确的实验结果。