血清灭活/制备/保存/使用问题的总结

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一、血清灭活问题。

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗?

答：不是必须的，看做什么实验了。

2、问：四季青胎牛血清灭活是56℃30分钟吗?

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

3、问：我要做滋养细胞培养 ，胎牛血清要灭活吗?

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗?因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影响转染?我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗?细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么?

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活!这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗?有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中;我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS ，有关系吗?

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物 污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗?

答：正常。

二、血清的保存问题。

1、问：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月还能用吗?

答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下一晚行吗?100毫升培养瓶加多少培养基呢?

答：可以放4℃。4-5ml。

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用?相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝试。

答：需要长期保存的胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

三、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗?答：多长时间啊?短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响?

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质， 在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清?

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢!

答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

五、血清的制备方法问题。

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程?

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活?

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用时再配。

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤?

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

六、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证?这样确实能节省不少血清的。

答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊，难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续用多久呢?

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。