变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验操作技术方法与步骤

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变性梯度凝胶电泳 主要分离原理是利用DNA链的熔解性质达到分离目的，低熔点和高熔点的DNA局部解链的程度不同，分子的迁移速率不通过，进而分离。

一、实验原理

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm)。Tm值主要取决于DNA分子 中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹(GC clamp)就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR 产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：(1)突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。(2)检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。(3)非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。(4)操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。(5)重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

二、实验用品

1.PCR扩增仪;变性梯度凝胶电泳仪;凝胶成像及分析系统;紫外透射仪;高速离心机;电泳仪;电泳槽。

2.尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖

3.微量加样器(200μl，20μl);Tip头(200μl，20μl)。Tip头盒(200μl，20μl);Eppendorf管(0.5ml，0.2ml)，Eppendorf管架。

4.PCR扩增相关试剂

三、实验步骤

1.PCR反应(同前)

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3.垂直变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0～100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件(即变性浓度)。

PCR产物加上样缓冲液后上样，300～400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2～4小时。

4.平行变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。

PCR产物加上样缓冲液后，25μl～30μl/孔，电压150V，温度60℃，时间3～6小时。

5.染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。

注意事项： 变性梯度凝胶电泳实验中操作中所使用的实验药品和试剂很多都有毒，且具有致癌、变性等毒害作用，一定要严格按操作步骤，保护自己免受实验伤害。