核糖核酸探针

核糖核酸探针

 

1． 室温下，于 1.5ml 无菌微量离心管内依次加入：

5 μ l               5 ×转录缓冲液

1 μ g               模板 DNA

1.2 μ l             10 mmol/L rATP （终浓度为 480 μ mol/L ）

1.2 μ l             10 mmol/L rCTP （终浓度为 480 μ mol/L ）

1.2 μ l             10 mmol/L rGTP （终浓度为 480 μ mol/L ）

1 μ l               1 mmol/L UTP （终浓度为 40 μ mol/L ）

1 μ l               0.75 mol/L 二硫苏糖醇

1 μ l               RNase Block Ⅱ或 0.5 μ l RNasin

5 μ l               α -[³² P]UTP （ 2.5 μ mol/L 终浓度， DEPC 水加至 25 μ l ）

1 μ l               T3, T7 或 SP6 RNA 聚合酶（ 10U ）

2． 37 ～ 40 ℃温育 60min 。

3． 若不做凝胶纯化步骤，则：

a.       加入 1 μ l 无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶并在 37 ℃温育 15min 。

b.      加 DEPC 处理水将体积增至 100 μ l 。加 100 μ l 苯酚：氯仿：异戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）溶液再提取一次。

c.       再加入 100 μ l 氯仿：异戊醇（ 24 ： 1 ）溶液再提取一次。

d.      加 0.5 倍体积 7.5mol/L 乙酸铵及 2 倍体积乙醇，置干冰中 30min 。

e.       10 000 × g 离心至少 5 min （去除上清液并用盖革计数器监控）。

f.        用 100 μ l 1mol/L 乙酸铵重悬沉淀小团，重复 d ～ e 步骤。

g.       真空（真空旋转蒸发 / 浓缩仪）干燥沉淀小团，用 DEPC 水重悬沉淀小团，取 1 μ l 置液闪仪计数。

4． 若需做凝胶纯化，则：

a.       将无 RQ1 RNA 酶的 DNA 酶处理步骤省去。

b.      制备测序凝胶（ 5 ％聚丙烯酰胺 /6mol/L 尿素）

c.       加 DEPC 水将核糖核酸探针溶液体积增加至 100 μ l ， 100 μ l 苯酚：氯仿：异戊醇（ 25 ： 24 ： 1 ）溶液提取一次， 100 μ l 氯仿：异戊醇（ 24 ： 1 ）再提取一次。

d.      加 0.5 倍体积 7.5mol/L 乙酸铵，加 2 倍体积乙醇置干冰 30 分钟。

e.       10 000 × g 离心至少 5min （去除上清液，并用盖革计数仪监控），真空干燥，用 5 μ l DEPC 水重悬沉淀。

f.        加 10 μ l 上样缓冲液，全部的样品上样电泳（样品上样前加热到 85 ℃ 5min 即置入冰中），在 60W 条件下至少电泳 1.5h 。

g.       去除玻璃板，用塑料薄膜包裹凝胶， X 射线胶片曝光 30 ～ 60s ，核糖核酸探针所处位置呈现自显影像，用剃须刀准确切下相应凝胶条带。

h.       凝胶条用 400 μ l 洗脱缓冲液， 37 ℃下，连续振荡洗脱 4h 。洗脱液移入干净离心管，盖革计数器检测洗脱液及凝胶条块（洗脱液中计数值应高于凝胶条）。

i.         加 1 μ l 冰冷乙醇并静置冰浴 15min 。

j.        10 000 × g 离心 15min ，乙醇沉淀。 RNA 沉淀用 DEPC 水再溶解，取 1 μ l 置液闪仪计数。