帕金森体外模型

体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型
l实验操作：实验采用胚胎龄14一16天的大鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。可将多个胚胎来源的组织收集在一起，置Fl2培养基（Gibco）至35mm的培养皿中，以细剪刀剪碎。将2ml含0.125％的胰酶的F12加入到组织中，该混合物于37oC孵育10分钟后，加入DNase I（Sigma）至终浓度80ng／m1，继续于37oC孵育10分钟。消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。该细胞悬液以种植培养基稀释（种植培养基： MEM，补充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg／ml谷胱甘肽，10 units／ml青霉素，10ul/ml链霉素和7.5％胎牛血清）。细胞然后种植于35mm的预先以10ug／m1 po1y1ysine （Sigma）和2.5ug／ml merosin（Chemicon）铺底的培养皿中，种植密度为50,000细胞／cm2。培养16小时后，培养基换为无血清培养基。该培养基为F12和basa1Eag1e’s medium，补充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氢钠，10mM HEPES（pH7.0），1ug／ml谷胱甘肽，20ug/ml胰岛素， 100ug/ml转铁蛋白， 60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亚硒酸钠（NaSe），30nM三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素。
毒物处理：于第4天以1uMMP+处理48小时。然后进行分析。
模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。

体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型
采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎，移入0.25％胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的DMEM培养液混匀，1000rpm，10min离心收集细胞，反复2次，后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞，过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5％CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔2天更换一次培养液。培养至第六天时加入100uM的6-OHDA处理3小时后吸出。在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全DMEM培养液继续置5％CO2培养箱中培养24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。