如何使昆虫细胞适应新的培养液

市场上供应的大多数培养液的配方非常接近，这使得细胞很容易适应新的培养液。这里我将详细介绍一个方法，这个方法是保守的，在大多数情况下可以进行删减一些步骤。最简单最节省时间的情况是把细胞直接分装到新的培养液中，观察几代以保证细胞的生长参数是可以接受的。这个方法适于悬浮细胞，不过也很容易扩展到贴壁细胞。

细胞的生长参数

1 ．翻倍时间（ Doubling Time ）

细胞的翻倍时间在评价昆虫细胞健康程度的参数中是最容易测量的。翻倍时间应该在细胞处于对数期复制时测量，对于 Sf9 和 Sf21 细胞来说通常是介于 16-24 小时之间，不过大多数在 20-22 小时。

dt=t × ln2/ln(Ct/Co) ，其中 dt 为翻倍时间， Co 为起始细胞数目， Ct 为经过时间 t 后的细胞数目， t 为 Co 和 Ct 两次计数之间的间隔时间，所有的时间都以小时为单位。

2 ．细胞大小（ Cell Size ）

细胞的大小是监测细胞健康程度的一个非常有用的参数。如果细胞是健康的，细胞的大小均一，都处于该细胞株体积正常变化范围的下限。细胞的大小在不同的细胞株变化是很大的。对于我用过的 Sf9 和 Sf21 ，典型的直径是 16-18 m m ，不过我知道有些细胞株小至 14 m m 或者大至 19 m m 仍然很健康。

3 ．滞后期（ Duration of Lag ）

当细胞的密度较低时，会有一个滞后期，其长短取决于分装或者传代后细胞的密度。一般说来，该密度越低，滞后期越长。对于一个特定的细胞株来说，当这个密度高出一个阈值时，滞后期的长短与密度无关；而低于一个阈值时，滞后期无限长，细胞不再增殖。

4 ．低密度分装极限（ Low Density Split Tolerance ）

能够在一个较短的滞后期（小于 12 小时）复苏的细胞形状较好。不过这是细胞株的特性，需要进行实验来确定你的细胞株的密度极限。我的细胞株有些在分装成密度为 5 × 10⁴ 细胞 /ml 时仍然可以很好复苏，有些细胞株分装成 5 × 10⁵ 细胞 /ml 就不能复苏了。

5 ．高密度极限（ High Density Maximum ）

这是你的细胞能生长的最大密度，高于这个密度你的细胞将进入平台期。这个指标既和细胞株有关，又和使用的培养液有关。我建议先把你的细胞株培养至平台期，然后把一些分装到新鲜的培养液中以后，使剩下的继续生长至平台期，同时密切监测细胞状况。一般来说，细胞的培养要避免密度超过高密度极限的 80% 。对于我培养的细胞，这个极限值从 2 × 10⁶ 至 12 × 10⁶ 细胞 /ml 不等。

实验步骤

第一阶段：

1 ．准备合适体积的由 25% 体积新培养液和 75% 旧培养液（即细胞原先适应的培养液）组成的混合培养液 I 。

2 ．将细胞以通常分装时使用的最低分装密度的两倍分装到混合培养液 I 中。

3 ．使细胞生长到通常培养时的较高密度，监测细胞生长参数。

4 ．继续以步骤 2 中的密度分装细胞到新鲜的混合培养液 I 中，直到生长参数达到可以接受的水平。有时候分装一次就可达到要求。

5 ．一旦细胞稳定下来，以通常使用的最低分装密度分装细胞至新鲜的混合培养液 I 中，同样监测细胞参数。

6 ．细胞达到较高密度后，继续以步骤 5 中的分装密度把细胞分装到新鲜的混合培养液 I 中，直到细胞的生长参数达到可以接受的水平。

7 ．如果细胞恢复到正常状态，进行第二阶段的实验。

8 ．如果细胞不能达到正常状态，新培养液可能不适于培养这种细胞。

9 ．如果细胞在新培养液中的生长参数达到平衡状态，虽然与正常状态不同，但是可以为实验接受，也可进行第二阶段的实验。

第二阶段：

1 ．准备适量的由 50% 新培养液和 50% 旧培养液组成的混合培养液 II 。

2 ．将细胞以两倍最低分装密度分装至混合培养液 II 中。

3 ．如第一阶段一样，监测细胞生长指数，使细胞达到稳定状态。然后将分装密度降到最低分装密度，再使细胞达到稳定状态。

第三阶段：

步骤同第一阶段和第二阶段，使细胞适应混合培养液 III （ 75% 新培养液和 25% 旧培养液）。

第四阶段：

1 ．步骤同第一阶段、第二阶段和第三阶段，使细胞适应新培养液。

2 ．当细胞在新培养液中达到稳定后，监测细胞的生长指数，看是否波动过大。