CAT的测定方法：高锰酸钾法

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当植物暴露在逆境中或者发生衰老的时候，就会加强体内活性氧的代谢，因而会产生较多的过氧化氢，并且积累下来。 过氧化氢会对植物细胞产生损伤，因为它能够直接或间接让核酸、蛋白质等发生氧化现象，也可以破坏细胞膜 的构造，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除 过氧化氢 ，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用高锰酸钾滴定法测CAT活性。

高锰酸钾滴定法

一、原理

过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和分子 氧，可根据 H 2 O 2 的消耗量或 O 2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的 H 2 O 2 溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的 H 2 O 2 ，即可求出消耗的 H 2 O 2 的量。

5H 2 O 2 +2KMnO 4 +4H 2 SO 4 → 5O 2 +2KHSO 4 +8H 2 O+2MnSO 4

二、实验材料、试剂与仪器设备

(一)实验材料

植物 叶片。

(二)试剂

1 . 10 % H 2 SO 4 。

2 . 0.2 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8 。

3 . 0.1 mol/L 高锰酸钾标准液：称取 KMnO 4 ( AR ) 3.1605 g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000 mL ，用 0.1 mol/L 草酸溶液标定。

4 . 0.1 mol/L H 2 O 2 ： 30 % H 2 O 2 大约等于 17.6 mol/L ，取 30 % H 2 O 2 溶液 5.68 mL ，稀释至 1000 mL ，用标准 0.1 mol KMn0 4 溶液(在酸性条件下)进行标定。

5 . 0.1 mol/L 草酸：称取分析纯 H 2 C 2 O 4 · 2H 2 O 12.607 g ，用蒸馏水溶解后，定容至 1000 mL 。

(三)仪器设备

研钵， 50 mL 三角瓶 14 个， 10 mL 酸式滴定管，恒温水浴锅， 25 mL 容量瓶 1 个。

三、实验步骤

1 .酶液提取 称取小麦叶片 2.5 g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 25 mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容， 4000 r/min 离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2 .取 50 mL 三角瓶 4 个( 2 个测定， 2 个对照)，测定瓶中加入酶液 2.5 mL ，对照瓶中加入煮死酶液 2.5 mL ，再加入 2.5 mL 0.1 mol/L H 2 O 2 ，同时计时，于 30 ℃恒温水浴中保温 10 min 后，立即加入 10 % H 2 SO 4 2.5 mL 。

3 .用 0.1 mol/L KMnO 4 标准溶液滴定 H 2 O 2 ，至出现粉红色(在 30 min 内不消失)为终点。

四、结果计算

酶活性用每克鲜重样品 l min 内分解 H 2 O 2 的毫克数表示：

酶活 [mg/ ( g ? min ) ] = 式中： A ——对照 KMnO 4 滴定毫升数( mL )。

B ——酶反应后 KMnO 4 滴定毫升数( mL )。

V T ——酶液总量( mL )。

1.7 —— l mL 0.1 mol/L 的 KMnO 4 相当于 1.7 mg H 2 O 2 。

FW ——样品鲜重( g )。

V 1 ——反应所用酶液量( mL )。

t ——反应时间( min )。

注意事项：所用高锰酸钾溶液及过氧化氢溶液在每次使用前要重新进行测定。