利用荧光分光光度法定量维生素B2的操作小技巧

互联网2013-08-27

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维生素B12在一定波长的光照射下，会发出绿色荧光，制作多维葡萄糖粉试样的标准曲线，根据荧光强度可以计算多维葡萄糖粉中维生素B12的含量。

实验目的

Ø学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。

Ø掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2 的方法。

荧光分析法实验原理

常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：

当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：

这是荧光光谱法定量分析的理论依据。

荧光分析法的特点

a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。

b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。

970CRT荧光光度计(上海分析仪器总厂)

5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只

10.0μg·mL-1VB2标准溶液(置阴暗处保存)，冰乙酸(AR)，

多维葡萄糖粉试样

c. 所需试样量少、操作方法简便。

荧光光谱

激发光谱

激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

发射光谱

发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。

固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。

多维葡萄糖粉中维生素B2含量的测定

维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：

维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。

实验预习

v预习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。

v了解荧光光度计的操作步骤和测定多维葡萄糖粉中维生素B2 的方法。

仪器与试剂

970CRT荧光光度计(上海分析仪器总厂)

5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只

10.0μg·mL-1VB2标准溶液(置阴暗处保存)，冰乙酸(AR)，

多维葡萄糖粉试样

基本操作

1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。

2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长= 440 nm，发射波长=540 nm。

3. 样品测定。

4. 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。

实验步骤

1. 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：

在六个干净的50 mL容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50和3.00 mL VB2标准溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。

2. 未知试样的测定:

称取0.15-0.20 g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。

数据处理

1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。

2. 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB2含量。

注意事项和问题

维生素B12的在pH为6.0到7.0的条件下，发出的荧光强度最强，但是在碱性条件下维生素B12会分解，发射荧光集团被破坏，因此本实验需要维持在酸性条件下。