放射免疫技术（RIA）标记抗原实验

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抗原实验技术及研究进展

(一)原理

当抗原 遇到相应的抗体便形成抗原抗体复合物(Ag+Ab ↔Ag -Ab)，当用放射性同位素标记抗原再与相应的抗体结合便形成标记抗原和抗体复合物。即： Ag~DAb↔ Ag~FAb。

当标记抗原 和未标记抗原一起加入相应的抗体时则两种抗原产生相互的竞争，而生成有标记抗原和抗体复合物以及非标记抗原和抗体复合物。

生成标记抗原 抗体复合物与非标记抗原的含量在一定的限度内是呈反比的，所以利用这个原理去测定未知抗原或抗体。

如果Ag多则Ag~FAb~A即结合抗原 B)生成量减少，Ag~A即游离抗原F)的剩余量就多。相反，Ag少，则Ag~FAb生成量就多，Ag的剩余量就少。通过检测游离抗原F和结合抗原B，就可知未知抗原的存在与否以及含量的多少。

(二)放射免疫抗原 的制备

1、完全抗原 为了保证免疫反应的特异性，对放射免疫抗原要求的纯度较高，必须在90%以上。通常采用电泳、凝胶过滤、离子交换层析等技术获得较高纯度的抗原。纯化的抗原必须经过纯度鉴定才能使用。鉴定办法：通过电泳只出现一条沉淀线，或者以圆盘电泳进行纯度分析。

2、半抗原 要获得较好的免疫原性，必须将半抗原与蛋白质大分子的载体结合起来形成一个完全抗原。结合的载体，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纤维蛋白、甲状腺球蛋白、鸡卵蛋白等。连接方式则因半抗原的功能基团与蛋白质载体功能基团所决定。常用的连接剂有二亚胺、二异氰酸、过碘酸盐等。

(三)抗体的制备与提纯

见第八章免疫球蛋白的制备与提纯。

(四)抗原的标记

1.放射性同位素的选择 选择同位素的原则。

⑴ 定方法简单、经济、便于推广应用。

⑵ 易于防护。

⑶ 同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。

⑷ 对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。

⑸ 具有较高的计数效率。

目前常用的同位素有3H、125 I，其它还有14C、35S和32P等。① 3H 因所有的有机化合物中均含有氢，用3H来置换氢，不至于影响其原有化合物的化学性质。3H的半衰期长，是一个弱 衰变，能量低，便于防护。一次标记可以使用较长时间，采用闪烁仪测量，测量效力可达60%。3H标记要求条件较高，一般需由专门机构来承担，不易推广;② 125I 碘标记的化合物比度高，标记方法简便，而且标记物可在碘化钠晶体﹟型计数器上直接测定。125I发射 射线，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可用放射性I标记。目前，连接标记技术已有相当发展，致使许多非蛋白质和多肽的半抗原也可以用碘来标记。另外碘的放射能量较大，半衰期也较短。

虽然125I的放射比活性仅为131I的13%，但125I的半衰期较131I长，同位素丰度大，辐射损伤小，计数效率也较高，因此125I比131I更为常用。