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解读miRNA （MicroRNA）

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MicroRNA (miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体(pre-miRNA)并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA 5'端第一个碱基对U(尿苷)有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。

MicroRNA - 形式

1 . pre-miRNA

约70bp含MicroRNA 茎环结构的pre-miRNA。

制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体 、pre-miRNA病毒。

2. pri-miRNA

天然pri-miRNA

从染色体基因文库中调取300bp-1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体(普通载体或病毒载体)，以强大的CMV启动子操纵该300bp-1000bp microRNA。

人工pri-miRNA

选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体(普通载体或病毒载体)。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。

microRNA - 作用方式

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miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性(不改变mRNA丰度)，这种miRNA是目前发现最多的种类;第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA;第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA;当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3´端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。

microRNA - 特异性

研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。

细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象;20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。为了能够清楚地让读者弄清两者之间的差异之处，笔者特别将它们之间的差别划分入三个大的阶段：起源阶段、成熟阶段和功能阶段(即调节基因表达的作用阶段)。

在描述两者的差异之前，有必要先说一说它们的共同点：

1. MiRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成;

2. 它们都是Dicer酶的产物;

3. 它们在起干扰、调节作用时都会和RISC复合体结合;

4. 它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译;

microRNA - 差异

两者之间的主要差异：

起源阶段

SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后产生外源基因进入细胞(注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生双链RNA，来阻止这些异常基因的表达)。

MiRNA：是内源性的，是一种非编码的RNA;由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。

成熟过程

SiRNA：直接来源是长链的dsRNA(通常为外源);经过Dicer酶切割形成双链siRNA,而且每个前体daRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段。

MiRNA：在细胞核中转录的较大的pri-miRNA经由Drosha(一种RNAse Ⅲ酶)和Pasha(含有双链RNA结合区域)加工成为单链pre-miRNA;接着，发夹状、部分互补的pre-miRNA在细胞质中被Diceundefined(一种RNAse Ⅲ酶)酶切割形成miRNA;在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性。

功能阶段

siRNA：它与RISundefined(RNA诱导的沉默复合物，使用的AGO蛋白家族的成分为AGO2)结合，以RNAi途径行使功能，即通过与序列互补的靶标mRNA完全结合(与编码区结合)，从而降解mRNA以达到抑制蛋白质翻译的目的;它通常用于沉默外源病毒、转座子活性。

MiRNA:它和RISC形成复合体(利用的AGO蛋白家族成员为AGO1)后与靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3’端;它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译; miRNA能够调节与生长发育有关的基因。

注：RISC, RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex; RISC)的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。新的研究表明，与siRNA和miRNA结合的RISC复合物并不完全相同其中的AGO蛋白质有AGO1和AGO2之分。刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。从dsRNA引发RNAi的发生大致划分为三个阶段，即启动、剪切和扩增。

Dicer酶：新的研究表明siRNA成熟需要Dicer-2和R2D2蛋白，而miRNA则依赖Dicer1和它的伴侣loqs蛋白。

microRNA - 选择方法

1.pre-miRNA是最早采用的microRNA，拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷，可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差，而且，由于制备的microRNA较长，合成时RNA的错误难以避免(当合成RNA超过60bp时，出现一个碱基错误率约30%)，转录制备的pre-miRNA稳定性较好，但无flank结构，很少使用。质粒载体形式的pre-miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要，现已逐渐被pri-miRNA取代。

2.人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好，也有足够多的成功使用的经验报道，但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank，制备的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐渐较少使用。

3.原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是近来被首选方法。

4.pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。

5.慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lenti-virus时，病毒的质量批间差异较大。

AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lenti-virus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。

microRNA - microRNA的检测

越来越多的研究成果表明，miRNA 将在疾病，特别是癌症的诊断和治疗中起到积极的深远作用。与蛋白编码基因表达谱相比，用miRNA表达谱对癌症进行分型更加精确可靠。此外，在常规收集的、福尔马林固定、石蜡包埋的临床组织标本中，miRNAs都表现出较高的稳定性，更进一步预示其作为诊断性分子标记的巨大潜能。因此，研究特定细胞microRNA的表达图谱、筛选未知miRNA、探究每种miRNA的特定功能成为当前的研究热点。

目前常见的miRNA检测方法包括 Northern Blot、微阵列芯片、微球、实时荧光定量PCR等技术，然而由于以下原因而各具缺陷。首先，由于miRNA本身碱基数过少，使得探针碱基序列的选择受限。并且不同microRNA 具有不同的最适杂交温度，在相同的杂交条件下，往往会引起很大程度的错配杂交，从而限制了对于相似序列microRNA的高效识别。其次，由于miRNA 存在序列的高度相似性，所以检测的特异性往往难以保证。

目前市场占主导地位的商品是Invitrogen 公司(原ABI公司)开发的实时荧光定量PCR方法(TaqMan microRNA检测方法)，该方法虽然在一定程度上克服了上述缺陷，但是仍具有高成本等缺点，限制了其广泛应用。

北京赛诺亚生物技术有限责任公司(www.sirnoa.com)自主开发出了方便实用的高通量miRNA检测方法：等温实时荧光定量miRNA检测 。该技术具有高特异、高灵敏度、低成本等特点。而且，样品不需要经过特殊处理，可直接提取RNA后用来检测，检测灵敏度高达1000拷贝数;相对于市场上占主流的Invitrogen TaqMan miRNA检测方法，该方法在成本和特异性等方面具有明显优势。