关于RNA酶保护试验优缺点的个人体会

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核糖核酸酶保护实验

RNA酶保护试验实际上是很早就出现的技术。在1982年出版的第一版圣经(分子 克隆)还没有提到。在1989年出版的第二版中已经出现：7.71 Mapping of RNA with Ribonuclease and Radiolabeled RNA(可参见中译本P383-387)。在2001年出版的第三版中的第七章用了大量的篇幅介绍这一技术，可参见科学出版社的第三版中译本P567-577，其中有RNA酶保护试验的用途、优缺点、所用试剂、操作程序等。

根据实验的经历，我感觉到这个方法的的主要缺点如下：

1.这个实验的前提是你必须首先要把要研究的基因克隆于一个载体 ，要清楚插入片段的方向，该载体插入片段两侧有T3、T7或SP6的启动子位点。载体先要用合适的内切酶线性化，选择正确的体外转录试剂盒，转录出要研究的mRNA 的互补链，再纯化。总之RNA探针的制备够麻烦。

2.核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。

3.要用放射性同位素。从事生物研究的人谁不接触放射性物质?但是该方法中不同于一般的探针标记，体积小，防护容易。它需要做垂直板状PAGE，还要漂洗固定，粘有放射性的物质太多，如电泳的缓冲液、电泳槽 、玻璃板、漂洗固定液及托盘。这还没有算上RNA探针标记及随后的纯化过程。如果非同位素的标记和检测能够达到相同的灵敏度和不太昂贵的话，那太好了。