DNA提取方法进展综述

相关专题

 

张宁，王凤山

(山东大学药学院生化与生物技术药物研究所 ，山东济南250012

《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期)

摘要：DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所 必需的条件。近年来一些新的或改进的DNA提取纯化方法不断出现，本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物提取DNA的方法进行综述。

关键词：DNA；提取；动物 ；植物 ；微生物 ；海洋生物

Advances of DNA extraction methods

ZHANG Ning，WANG Feng-shan

(Institute o f Biochemic and Biotechnological Drugs，School of Pharmacy，Shandong University,

Jinan 250012，China)

Abstract：DNA extraction is a basic technology of molecular biology. The purity and the integrality of DNA structure are necessary for different experiments of gene engineering. In recent years there have been some new or improved DNA extraction methods appeared. The methods of DNA extraction from animals，plants，microorganisms and marine organisms were summarized in this article.

Keywords：DNA；ex traction；an imals；plants；microorganisms；marineo rganisms

自 20 世 纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋 模型以来，分子 生物学在广度和深度上都获得空前的发展。DNA作为分子生物学 研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深人，在此基础上产生的基因工程 技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，为此针对不同来源的DNA建立了不同的提取纯化方法。本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。

1.动物来源的DNA的提取

1. 1经典提取方法

酚抽提法 、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。

1.2 玻璃棒缠绕法

该 法 用 盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸人TE中过夜，使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高，但简单快速。

1.3 血细胞DNA的快速提取法

采用 非 离 子变性剂NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞，提取细胞核 ，然后用酚/氯仿抽提DNA。这样从血液中分离获得的DNA纯度高，能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween -20同时作用破碎细胞膜，以避免SDS对以后步骤的负面作用。 Ba sun i等 [‘〕采用了4种常用的从血液中提取DNA的方法：High Pure Viral Nucleic 试剂盒法、QlAamp试剂盒法、Tri- PureTM试剂分离提取法以及经典酚抽提法，对通常作抛弃处理的血凝块进行人DNA 及病毒DNA的抽提，发现前两种方法可以迅速高效获得目的DNA，从而建立了由血凝块中提取DNA的方法，扩大了临床检验样本的来源。

1. 4 玻璃颗粒吸附法

在该 法 中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞，然后加人含有能够与DNA 结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以与DNA 进行结合，一定大小的硅胶颗粒也可以与 DNA进行结合，据此，不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA 的提取方法。 Pichler等[2〕在从抹香鲸(Physeter macrocephalus) 牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法，从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物，此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。 Caldarelli-stefano等[3〕在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DNA时利用小磁珠作为结合核，也获得了理想的纯化 DNA。很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒，Pint。等[4]就探讨了采用 Gibc。公司的GlassMAX系统，对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法，目前这些试剂盒在临床上广为应用，省时省力。

1.5 三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)法

由于 常 规 方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握，采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。 TLS是一种较强的表面活性剂，将其直接作用于细胞或组织匀浆，可迅速溶解细胞膜、核膜，而且蛋白质与其结合后即失去对DNA 的结合，进一步的纯化可采用常规方法。

1. 6 临床病理标本的DNA提取方法

由于 PC R技术不仅可用于基因分离、核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。近年来，PCR技术已广泛应用于病理学研究，尤其对福尔马林固定石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关注的焦点。对于从这些病理标本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，该法虽然效率较高，但费时费力，而且其操作中要求多次离心，增加了样品污染的可能性。近年来很多高效灵敏的方法在实践中得以采用，这些方法通常采用加热或微波法〔s〕去除包埋的石蜡，使用Sephadex G- 5。柱色谱或盐析法[s7等去除蛋白质。高文涛[71等在研究福尔马林固定石蜡包埋组织 DNA提取方法对PCR的影响时，发现在组织切片中加人鳌合树脂(Chelating Resin，亚氨基二乙酸)提取获得的DNA可取得较好的PCR扩增结果。Coombs等〔s〕则采用热循环方法，将标本上的蜡融人样品溶液，在酶的作用下进行裂解，然后用Chelex-100进行吸附，离心去蜡，这种方法安全、简便、有效、经济。

1.7 盐析法

该 法用 饱 和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的DNA质量可以满足PCR模板的要求，但产率相对较低，纯度较差。谭建明等[9]对上述盐析法进行了改进，即将处理过的样本加人SDS和蛋白酶K后，在56"C 消化1h，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并经离心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。该法简化了DNA的抽提步骤，可用于人体各种样本DNA的提取，所获DNA的纯度可以满足各种检测的需要。