① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序滴加，是否孵育了足够的时间。
③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配。如，一抗是兔来源，一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是羊来源，必须用抗羊的二抗来匹配。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否正确。一抗的稀释液不能用来稀释二抗。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体。不要与挥发性有机溶剂一起保存，以免降低抗体的效价。要求冷冻保存的抗体，尽量避免反复冻融。
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本做阳性对照。
⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧ 检查复染剂和封片剂和所使用的显色剂是否匹配。
⑨ 检查抗原处理方式是否正确，有些不正确的处理方式会破坏染色。如：Collge Ⅳ只能用酶消化，热修复会破坏染色。
