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Real time PCR 实验注意事项

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实验中的一些好习惯
加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均
移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性
一定要记着关水浴箱,切记切记
多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了
所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因
防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。
但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
(一)动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、 关于Trizol Reagent需要的试剂
1. Chloroform:氯仿 (分析纯)
2. Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)
3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4. RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul),在37℃过夜,并高压灭菌即得(150℃ 3小时)
5. 一次性塑料手套
6. 注意:DEPC有致癌之嫌
二、 关于Trizol Reagent的使用过程:
1. Homogenization(匀浆)
a. Tissues:组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
b. Cells Grown in monolayer(单层细胞接毒后出现病变的)
针对JEV细胞总RNA的抽提法:
BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml(采用大瓶),37℃吸附1h,倒掉,加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml,维持天。出 现75%-100%的病变时,以PBS(预冷)冲洗细胞两次,直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞(细胞瓶有两 种常用规格:大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定,以盖满瓶 底为度,而不是依据细胞的数量,否则可导致DNA的污染)具体方法如下:(样品一定要新鲜)
(1) 组织接入预冷的EP管中,加入Trizol试剂1ml/10cm2(量一定要加足,否则易污染),混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底分离。
(2) 加氯仿0.2ml(每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml),盖好,剧烈震荡15s,置室温2-3分钟。
(3) 4℃离心,10000g×15min,离心后,混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
(4) 仔细吸取上层水相,移至另一EP管中。
(5) 加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA(每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇),置室温10min。
(6) 4℃离心,10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
(7) 弃上清液,加入预冷的75%乙醇1ml(每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml),震荡,充分洗涤沉淀,4℃离心,5500g×5min。弃上清液,空气干燥(或真空干燥)后,沉淀重悬于无 Rnase dH2O中,吹吸几次,55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA,-70℃保存备用。
(8) 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为:A260/280 ratio<1.6。
(9) 分离组织10mg(纯组织)加800ul Trizol试剂。
(10) 扩增产物的鉴定:。
DEPC处理方法如下:
1. DEPC处理
(1)DEPC水:100ml超纯水加入0.2ml DEPC,充分混匀,高压灭菌。
(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200&mu;l、20&mu;l Tip头;EP管和PCR反应管等):用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1ml DEPC)37℃浸泡过夜,高压灭菌。
2. 提取RNA,用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR仪来控制温度和时间的,所以RT是在PCR反应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套,并经常换手套。
最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下,枪头盒插好枪头后,加入1-2ml的0.1%DEPC水,在灭菌就行了;现在有进口的RNASE FREE的枪头买,直接用不用处理的
如何消除污染
机器运行完后,取出PCR产物时不能随便丢弃,应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
(1) 试剂:mixer尽量分装,不要原瓶多次取用。
(2)加样:原则是DNA最后加,其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染。
另外,普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系,最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目 前,国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶,来源于大肠杆菌重组克隆表达。
RNA定量
RNA也最好至少要用电泳,一方面定量,另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。
RNA的贮藏,最主要的是温度,-20不够,最好-80,液氮最保险
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的,因为还有翻译效率和RNA降解速度 的影响
RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行
一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达 量,不是绝对表达量
mRNA的分离与纯化中
步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结 合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
下面,我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3)保温试验
方法很简单的,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件), 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染与对策
)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题,所以,扩增区的仪器什么如枪头等要注意。
还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及 污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
1标本处理区,包括扩增摸板的制备;
2. PCR扩增区,包括反应液的配制和PCR扩增;
3. 产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备&rarr;PCR扩增&rarr;产物分析&rarr;产物处理。
切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;
操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度
反应液污染
可采用下列方法之一处理:
1. DNase I法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活,然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列;
(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右,因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干,高压灭菌,再烘干。
2、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢?还要用双蒸水洗吗?
3、玻璃器皿干烤:180度,8小时或更长时间;小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外,铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。

(责任编辑:大汉昆仑王)
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