细胞免疫功能的检测

 

第三节　细胞免疫功能的检测

细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化

一、迟发型过敏反应的体外检测方法

皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。

1．皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。

2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。

二、细胞免疫的体外检测方法

体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。

1．T细胞计数

（1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5～10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。

（2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3+细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%～80%。正常人的CD4+细胞和CD8+细胞之和应与CD3+细胞数一致。CD4+细胞与CD8+细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。

2．T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数（表20-3）。

表20－3　淋巴细胞增殖反应的刺激物

分裂原 T细胞 B细胞 植物血凝素（PHA） + － 刀豆蛋白A（ConA） + － 美洲商陆（PWM） + + 葡萄球菌蛋白A（SPA） ±� + 副伤寒杆B（SPB） ± +

注： PWH主要是T细胞分裂原，也可通过刺激T细胞分泌可溶性因子诱导B细胞增殖分化；

�SPA诱导B细胞分裂不需要T细胞协助，但诱导B细胞激活抗体分泌细胞需要T细胞协助

3．细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50：1或100：1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。

细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。

4．混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4～5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时，然后测定清液中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时，特别是AIDS病人，IL-2分泌明显降低。而有些疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2水平升高，表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。

　　也可用酶联免疫吸附试验测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体（CD25），一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的，IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测，如移杆排斥、 自身免疫 病以及接受免疫抑制治疗的病人。

　　对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查 细胞培养 上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的cDNA探针作分子杂交试验，即印迹（dot blotting）或Northern印迹，若查出有某种因子的mRNA存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。