底物浓度对反应速度的影响

 

 

 

 

在酶的浓度不变的情况下，底物浓度对反应速度影响的作用呈现矩形双曲线(rectangular hyperbola)(图2-8)。

图2-8 底物浓度对反应初速度的影响

在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为0级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。

(一)米曼氏方程式

解释酶促反应中底物浓度和反应速度关系的最合理学说是中间产物学说。酶首先与底物结合生成酶�孜锔春衔?中间产物)，此复合物再分解为产物和游离的酶。

Michaelis和Menten在前人工作的基础上，经过大量的实验，1913年前后提出了反应速度和底物浓度关系的数学方程式，即著名的米��戏匠淌?michaelis menten equation)．

V=Vmax[S]/Km+[S]

Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。当底物浓度很低时，[S]《Km,则V≌Vmax/Km[S]，反应速度与底物浓度呈正比。当底物浓度很高时，[S]》Km，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度(图2-9)。

图2-9 酶与不同浓度的底物相互作用模式

(二)米－曼氏方程式的推导

米－曼氏方程式提出后又经riggs和Haldane的充实和发展，经补充和发展的米－曼氏方程工推导如下：

(1)��

式中K1、K2、K3、K4分别为各向反应的速度常数。

从式(1)中知，ES的生成途径来自E+S和E+P，但其中E+P生成ES的速度极小(尤其在起始阶段，P的生成很少)，可以忽略不计，又因为底物浓度大大超过酶的浓度，[S]》[E]，中间产物ES中的S浓度可以忽略不计，因此，ES的生成速度为：

 

d[ES]	＝	K1([Et]-[ES])・[S]	(2)
dt

��其中［Et］-［ES］为游离酶的浓度，ES的分解速度为：

  

-	[ES]	=	K2[ES]+K3[ES]=(K2+K3)[ES]	(3)
dt

当反应体系处于稳态时，ES生成和分解的速度相等，即

���K1(［Et］-［ES］)・[S]=(K2+K3)［ES］�

 

K2+K3	=	[Et]-[ES]	・[S]
K1	[ES]

令K2+K3／K1=Km　则　Km=［Et］-［ES］／［ES］・[S]��

��［ES］=[Et][S]/Km+[S]　　　 (4)

由于反应速度取决于产物P的生成量，故

���V=K3［ES　　　 (5)

在酶促反应达最大速度时，所有的酶分子都已与底物结合形成中间产物，此时

���［Et］=［ES］　　　 (6)

那么　Vmax=K3［Et］　　　 (7)

在(4)式两边乘以K3得：

K3・［ES］=K3・［Et］[S]／Km+[S]　以(5)和(7)式代入，即：��

V=Vmax[S]／Km+[S]

(三)米氏常数的意义

当反应速度为最大速度一半时，米氏方程可以变换如下：

���½Vmax=Vmax[S]／Km+[S]

��进一步整理可得到：

��Km=[S]��

可知，Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。

因为Km=K2+K3／K1，当K2》K3，即ES解离成E和S的速度大大超过分离成E和P的速度时，K3可以忽略不计，此时Km值近似于ES解离常数KS，此时Km值可用来表示酶对底物的亲和力。

Km=K2/K1=[E][S]/［ES］=KS��

Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。但是KS值并非在所有酶促反应中都远小于K2，所以Ks值(又称酶促反应的底物常数)和Km值的涵义不同，不能互相代替使用。

Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M之间。

当K3不远远小于K2和K1时，Km表示整个反应的化学平衡的常数。

如果Km值已知，任何底物浓度时酶的饱和度(形成中间产物的酶占总酶的比例，saturation fraction fEs)fEs便可计算出来。

fES=［ES］／［Et］=K3［ES］／K3［Et］＝V／Vmax=[S]／Km+[S]

(四)Km和Vmax的求法

如图2?所示，底物浓度曲线是矩形双曲线。

从图中很难精确地测出Km和Vmax。为此人们将米氏方程进行种种变换，将曲线作图转变成直线作图。

1.双倒数作图(double�reciprocal plot or Lineweaver�Burk plot)

将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：

1／V=Km／Vmax・1／[S]+1／Vmax

从图2-10可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax,横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值。

图2-10 双倒数作图法

图2-11 v对v/[s]作图法

2.V对V〖〗[S][SX)]法(Eadie�Hofstee plot)

将米氏方程经移项整理后可写成

VKm+V[S]=Vm[S]

V[S]=Vm[S]-VKm

故V=Vm-KmV／[S]

以V为纵坐标对V／[S]横坐标作图，所得直线，其纵轴的截距为Vmax，斜率为Km(图2-11)。

必须指出米氏方程只适用于较为简单的酶作用过程，对于比较复杂的酶促反应过程，如多酶体系、多底物、多产物、多中间物等，还不能全面地籍此概括和说明，必须借助于复杂的计算过程。