丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

不同作物不同发育时期过氧化物酶同工酶的比较分析

互联网

1072
一、原理
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂四甲基乙二胺(简称TEMED)的作用下,聚合而成的具有三维网状结构的凝胶,通过改变聚丙烯酰胺单体的浓度和交联度可以控制凝胶孔径的大小。通过改变催化剂的用量,可以控制凝胶聚合的速度。本实验采用不连续的电泳体系。以聚丙烯酰胺为支持物,采用电泳基质的不连续体系,即凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性和电泳过程中自动形成的电位梯度的不连续性,使样品在不连续的两相之间积聚浓缩成很薄的起始区带(约10 -2 cm),然后再根据电荷效应和分子筛效应进行分离。
二、实验材料、 仪器 及试剂
1、材料:水稻芽 水稻幼苗 灌浆期的叶片 小白菜叶片 玉米叶片萌发4-5天的小麦芽
2、 仪器 :电泳仪 电冰箱 20×20(厘米)玻璃板一块
20×20(厘米)凹形玻璃板一块 玻璃注射器:
10毫升×1支 微量注射器 :100微升1支
小烧杯2个 研钵1个 小白瓷盘 1个
3、 试剂

G 过硫酸铵 0.56克 , 用水定容至100毫升,一般现用现配

F 蔗糖40g加水溶解定容至100mL。
E 电极缓冲液:

H 显色溶液:1. 称0.25克联苯胺溶解在18毫升冰醋酸中,用水稀释至100mL;
2.3%H 2 O 2
I 固定液:7%的醋酸溶液
J 前沿指示剂:0.1%溴酚蓝水溶液
三、操作方法
1、粘板:取一块20×20(厘米)的玻璃板,在板的左、右、下三方边缘处用马铃薯淀粉糊将三块20×1.5(厘米)的有机玻璃条分别粘合,然后再盖上一块20×20(厘米)的凹型玻璃板。这样有机玻璃条被夹在两块玻璃板之间,以便留下灌胶的空隙,用铁夹夹紧固定在一有机玻璃的支架上,检查是否漏水(漏水则要重新粘板)。
2、灌胶:⑴下层胶的配制:将A、C、G、水以1:2:1:4的比例混合配制24ml于小烧杯中,马上灌入两玻璃板之间,(高度约为板的三分之二)然后用注射器在胶面上加一层水,使下层胶面平整。待凝胶聚合后,倾去水层,再用吸水纸轻轻吸干。
⑵上层胶的制备:将B、D、G、F以1:2:1:4比例配8毫升灌注入下层胶上,高约为2-4厘米,立即插入一有机玻璃的梳状物,待上层胶凝固以后,取出梳状物,上层胶中即形成若干个凹形间隔(此间隔即是点样孔)。
3、电泳槽安装:将制好的板,从支架上取下,用镊子小心拨去下方的有机玻璃条,将靠凹形玻璃板一面与电泳槽粘合,用铁夹固定。
4、样品的制备和点样:⑴样品制备:取① 2克萌发1-2天的水稻芽;② 2克水稻幼苗;③ 2克灌浆期的叶片;④ 2克小白菜叶片;⑤ 2克玉米叶片;⑥2克萌发4-5天的小麦芽。剪碎后,分别放在研钵中,各加入5毫升稀释5倍的电极缓冲液,磨成匀浆后在6000转/分下离心5分钟,取上清液2ml加入等体积40%蔗糖混合,用微量注射器吸收100微升点入上层胶各间隔中,再加入1滴蔗糖。向上、下槽注满电极缓冲液,再在上槽加2滴溴酚蓝作前沿指示剂,将上槽接上负极,下槽接上正极,打开电源开关,调节电流约12mA,半小时后,将电流增至24mA。待前沿指示剂到距板下至1厘米左右时, 关闭电源,停止电泳。
5、取胶和染色:将板从电泳槽取下,用镊子拨去二根有机玻璃条再小心将凹板揭开,将胶片托起放入盛有显色剂的白瓷盘中,直到可见至清晰的过氧化物酶同工酶棕色谱带,弃去显色剂,用 蒸馏 水冲洗 胶片 ,然后,将 胶片 放入70%的醋酸溶液中保存。
四、结果观察和记录
五、注意事项
1.粘板一定要粘好,否则会漏胶。
2.电泳时,电流不可太大。太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行,以便于散热。
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序