不同作物不同发育时期过氧化物酶同工酶的比较分析
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一、原理
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶，通过改变聚丙烯酰胺单体的浓度和交联度可以控制凝胶孔径的大小。通过改变催化剂的用量，可以控制凝胶聚合的速度。本实验采用不连续的电泳体系。以聚丙烯酰胺为支持物，采用电泳基质的不连续体系，即凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性和电泳过程中自动形成的电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相之间积聚浓缩成很薄的起始区带（约10 -2 cm），然后再根据电荷效应和分子筛效应进行分离。
二、实验材料、 仪器 及试剂
1、材料：水稻芽 水稻幼苗 灌浆期的叶片 小白菜叶片 玉米叶片萌发4-5天的小麦芽
2、 仪器 ：电泳仪 电冰箱 20×20（厘米）玻璃板一块
20×20（厘米）凹形玻璃板一块 玻璃注射器：
10毫升×1支 微量注射器 ：100微升1支
小烧杯2个 研钵1个 小白瓷盘 1个
3、 试剂
G 过硫酸铵 0.56克 ， 用水定容至100毫升，一般现用现配
F 蔗糖40g加水溶解定容至100mL。
E 电极缓冲液：
H 显色溶液：1. 称0.25克联苯胺溶解在18毫升冰醋酸中，用水稀释至100mL；
2．3%H 2 O 2
I 固定液：7%的醋酸溶液
J 前沿指示剂：0.1%溴酚蓝水溶液
三、操作方法
1、粘板：取一块20×20（厘米）的玻璃板，在板的左、右、下三方边缘处用马铃薯淀粉糊将三块20×1.5（厘米）的有机玻璃条分别粘合，然后再盖上一块20×20（厘米）的凹型玻璃板。这样有机玻璃条被夹在两块玻璃板之间，以便留下灌胶的空隙，用铁夹夹紧固定在一有机玻璃的支架上，检查是否漏水（漏水则要重新粘板）。
2、灌胶：⑴下层胶的配制：将A、C、G、水以1：2：1：4的比例混合配制24ml于小烧杯中，马上灌入两玻璃板之间，（高度约为板的三分之二）然后用注射器在胶面上加一层水，使下层胶面平整。待凝胶聚合后，倾去水层，再用吸水纸轻轻吸干。
⑵上层胶的制备：将B、D、G、F以1：2：1：4比例配8毫升灌注入下层胶上，高约为2-4厘米，立即插入一有机玻璃的梳状物，待上层胶凝固以后，取出梳状物，上层胶中即形成若干个凹形间隔（此间隔即是点样孔）。
3、电泳槽安装：将制好的板，从支架上取下，用镊子小心拨去下方的有机玻璃条，将靠凹形玻璃板一面与电泳槽粘合，用铁夹固定。
4、样品的制备和点样：⑴样品制备：取① 2克萌发1-2天的水稻芽；② 2克水稻幼苗；③ 2克灌浆期的叶片；④ 2克小白菜叶片；⑤ 2克玉米叶片；⑥2克萌发4-5天的小麦芽。剪碎后，分别放在研钵中，各加入5毫升稀释5倍的电极缓冲液，磨成匀浆后在6000转/分下离心5分钟，取上清液2ml加入等体积40%蔗糖混合，用微量注射器吸收100微升点入上层胶各间隔中，再加入1滴蔗糖。向上、下槽注满电极缓冲液，再在上槽加2滴溴酚蓝作前沿指示剂，将上槽接上负极，下槽接上正极，打开电源开关，调节电流约12mA，半小时后，将电流增至24mA。待前沿指示剂到距板下至1厘米左右时， 关闭电源，停止电泳。
5、取胶和染色：将板从电泳槽取下，用镊子拨去二根有机玻璃条再小心将凹板揭开，将胶片托起放入盛有显色剂的白瓷盘中，直到可见至清晰的过氧化物酶同工酶棕色谱带，弃去显色剂，用 蒸馏 水冲洗 胶片 ，然后，将 胶片 放入70%的醋酸溶液中保存。
四、结果观察和记录
五、注意事项
1．粘板一定要粘好，否则会漏胶。
2．电泳时，电流不可太大。太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行，以便于散热。
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶，通过改变聚丙烯酰胺单体的浓度和交联度可以控制凝胶孔径的大小。通过改变催化剂的用量，可以控制凝胶聚合的速度。本实验采用不连续的电泳体系。以聚丙烯酰胺为支持物，采用电泳基质的不连续体系，即凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性和电泳过程中自动形成的电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相之间积聚浓缩成很薄的起始区带（约10 -2 cm），然后再根据电荷效应和分子筛效应进行分离。
二、实验材料、 仪器 及试剂
1、材料：水稻芽 水稻幼苗 灌浆期的叶片 小白菜叶片 玉米叶片萌发4-5天的小麦芽
2、 仪器 ：电泳仪 电冰箱 20×20（厘米）玻璃板一块
20×20（厘米）凹形玻璃板一块 玻璃注射器：
10毫升×1支 微量注射器 ：100微升1支
小烧杯2个 研钵1个 小白瓷盘 1个
3、 试剂
G 过硫酸铵 0.56克 ， 用水定容至100毫升，一般现用现配
F 蔗糖40g加水溶解定容至100mL。
E 电极缓冲液：
H 显色溶液：1. 称0.25克联苯胺溶解在18毫升冰醋酸中，用水稀释至100mL；
2．3%H 2 O 2
I 固定液：7%的醋酸溶液
J 前沿指示剂：0.1%溴酚蓝水溶液
三、操作方法
1、粘板：取一块20×20（厘米）的玻璃板，在板的左、右、下三方边缘处用马铃薯淀粉糊将三块20×1.5（厘米）的有机玻璃条分别粘合，然后再盖上一块20×20（厘米）的凹型玻璃板。这样有机玻璃条被夹在两块玻璃板之间，以便留下灌胶的空隙，用铁夹夹紧固定在一有机玻璃的支架上，检查是否漏水（漏水则要重新粘板）。
2、灌胶：⑴下层胶的配制：将A、C、G、水以1：2：1：4的比例混合配制24ml于小烧杯中，马上灌入两玻璃板之间，（高度约为板的三分之二）然后用注射器在胶面上加一层水，使下层胶面平整。待凝胶聚合后，倾去水层，再用吸水纸轻轻吸干。
⑵上层胶的制备：将B、D、G、F以1：2：1：4比例配8毫升灌注入下层胶上，高约为2-4厘米，立即插入一有机玻璃的梳状物，待上层胶凝固以后，取出梳状物，上层胶中即形成若干个凹形间隔（此间隔即是点样孔）。
3、电泳槽安装：将制好的板，从支架上取下，用镊子小心拨去下方的有机玻璃条，将靠凹形玻璃板一面与电泳槽粘合，用铁夹固定。
4、样品的制备和点样：⑴样品制备：取① 2克萌发1-2天的水稻芽；② 2克水稻幼苗；③ 2克灌浆期的叶片；④ 2克小白菜叶片；⑤ 2克玉米叶片；⑥2克萌发4-5天的小麦芽。剪碎后，分别放在研钵中，各加入5毫升稀释5倍的电极缓冲液，磨成匀浆后在6000转/分下离心5分钟，取上清液2ml加入等体积40%蔗糖混合，用微量注射器吸收100微升点入上层胶各间隔中，再加入1滴蔗糖。向上、下槽注满电极缓冲液，再在上槽加2滴溴酚蓝作前沿指示剂，将上槽接上负极，下槽接上正极，打开电源开关，调节电流约12mA，半小时后，将电流增至24mA。待前沿指示剂到距板下至1厘米左右时， 关闭电源，停止电泳。
5、取胶和染色：将板从电泳槽取下，用镊子拨去二根有机玻璃条再小心将凹板揭开，将胶片托起放入盛有显色剂的白瓷盘中，直到可见至清晰的过氧化物酶同工酶棕色谱带，弃去显色剂，用 蒸馏 水冲洗 胶片 ，然后，将 胶片 放入70%的醋酸溶液中保存。
四、结果观察和记录
五、注意事项
1．粘板一定要粘好，否则会漏胶。
2．电泳时，电流不可太大。太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行，以便于散热。
