沙门氏菌回复突变实验

目的 ：学习利用细菌检测基因突变的方法
Ames试验 即鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验，是目前检测基因突变最常用方法之一。
原理 ：利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株，其不能合成组氨酸，而必须由外界提供这种菌珠被称为营养缺陷式营养实变型（his-）。当诱变剂作用于菌株后，在菌株遗传物质的特定位点发生基因回复突变成为野生型（his+），故在缺乏组氨酸的培养基上，只存少数自发回变菌落生长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从而可判断被药物是否具有致实变性。
材料 ：菌株，鼠伤寒沙门氏菌TA97，TA98，TA100，TA102。
器材 ：恒温培养箱，干燥箱，高压消毒锅，水溶锅，紫外线灯（15w），药物天平，分析天平 酒精灯，滤纸片，平皿，试管，烧杯，吸管。
培养基配制
1．Vogel-Bonner液10×（VB液10倍浓缩）用于配制底层基本培养基。配制方法：硫酸镁（MgSO ₄ ·7H ₂ O）1g，柠檬酸（C ₆ H ₈ O ₇ ·H ₂ O）10g，磷酸氢二钾（K ₂ HPO ₄ ·3H ₂ O）65.5g，磷酸氢铵钠（NaNH ₄ HPO ₄ ·4H ₂ O）17.5g。将上述成分依次用蒸馏水溶解、混匀，然后加蒸馏水至500ml，置4℃冰箱保存。
2．底层基本培养基 取VB液（10倍）100ml，加入蒸馏水800ml，用1mol/L NaOH调pH至7.0，然后加入琼脂12—15g，经121℃20分钟高压灭菌。待冷至800C左右时，加入100ml已经112℃20分钟高压灭菌的20%葡萄糖液，混匀后浇制平板。
3．上层培养基 D- 生物 素12.4mg，L-盐酸组氨酸9.5mg，NaCl5g，琼脂6g，上述成分依次加热溶解，混合，然后加蒸馏水至1000ml。分装后经121℃15分钟高压灭菌备用。
方法
1．药物的剂量选择
对于易溶解的药物，实验最高剂量可采用抑菌浓度下的最大剂量，或以最大溶解度为最高剂量和5mg/皿为最高剂量，下设5个剂量，（即5000，500，50，5，0.5，0.1μg/皿）。溶剂：药物是水溶性，可用灭菌蒸馏水，如非水溶性可选二甲亚砜为溶剂。
2．平板掺入法
每皿加底层培养20～25ml，待凝固。取融化并保温于45℃的上层培养基，分装于5ml试管中，每支试管2ml，依次加入新鲜菌液0.1ml， 药物0.1ml，需加S9时则加入S9混合液0.3ml，混匀，迅速倒在底层培养基上，使之分布均匀。待上层琼脂凝固后，翻转平板置37℃培养48小时后，观察结果。
结果评价
观察结果时，首先应观察各实验组和阴性对照的背景菌苔的生长情况。在肯定背景菌苔与阴性对照相差不多后，再比较各剂量组的回变菌落数。若回变菌落数的出现有剂量反应关系，回变菌落数大于自发对照的2倍或以上，结果并具有重现性，并有统计学意义的增加，可判断为阳性，反之为阴性。

附录：Ames 试验记录表，实验者可视需要对表加快修改